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专利号: 2018104210045
申请人: 江南大学附属医院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种诱导人成纤维细胞转分化为人生殖细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1、将人成纤维细胞贴壁培养至第二代后的细胞产物接种于添加第一型诱导剂的人成纤维细胞染色体活化培养基中培养若干天,以进行染色体激活的诱导;所述人成纤维细胞染色体活化培养基为含有10wt%胎牛血清的高糖DMEM培养基,所述第一型诱导剂为500 μM VPA、10 μM CHIR99021、0.1 μM DZNep、0.1 mM Sodium butyrate、0.5 μM RG108和100 ng/ml Activin A的混合物;

S2、将步骤S1所获得的细胞进行消化后,细胞产物接种于添加第二型诱导剂的人生殖细胞诱导培养基中培养若干天,以进行生殖细胞的诱导;所述人生殖细胞诱导培养基为含有1wt%胎牛血清的StemPro‑34 SFM培养基,所述第二型诱导剂为100ng/ml BMP4、50ng/ml Wnt3a、20ng/ml GDNF、10 ng/ml EGF、1000U Lif、10 ng/ml bFGF的混合物;

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其中:所述步骤S1中的接种密度为2×10 3×10 /mL,所述步骤S2中的接种密度为2×~

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10 3×10/mL。

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2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤S1中的人成纤维细胞取自人脐带组织或包皮环切组织。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S1中的贴壁培养具体为:将人脐带组织、包皮环切组织使用无菌剪刀剪成2 mm×2 mm左右的小块组织,进行贴壁培养,置入37℃,5% CO2的恒温培养箱中静止培养7天,其中,贴壁培养所使用的基础培养基为人成纤维细胞培养基,即高糖DMEM培养基;

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使用0.25%胰酶处理5分钟,终止胰酶反应,收集细胞后离心,按照2×10 3×10/mL的~

接种密度接种于人成纤维细胞染色体活化培养基中,然后向人成纤维细胞培养基中添加第一型诱导剂20~30μl,置入37℃,5% CO2的恒温培养箱中静止培养7天,观察细胞形变。

4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S2具体为:将步骤S1所获得的细5

胞进行使用0.25%胰酶‑EDTA处理5分钟,终止胰酶反应,收集细胞后离心,按照2×10 3×~

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10/mL的接种密度接种于人生殖细胞诱导培养基,并向人生殖细胞诱导培养基添加第二型诱导剂20 30μl,置入37℃,5% CO2的恒温培养箱中静止培养13天。

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5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤S2中经过诱导得到的生殖细胞为精原干细胞。