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专利号: 201810421118X
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,包括:外消旋异丁基丁二腈在反应介质中,腈水解酶和酰胺酶催化下,20~50℃温度下,反应

4~10h,得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸。

2.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的腈水解酶为芜菁腈水解酶BrNIT、BrNIT2、拟南芥腈水解酶AtNIT或高山南芥腈水解酶AaNIT中的一种或几种。

3.根据权利要求2所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的腈水解酶为AaNIT。

4.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的酰胺酶为Pa-Ami、Cc-Ami或Dt-Ami中的一种或几种,所述的酰胺酶的选用顺序为Pa-Ami>Dt-Ami>Cc-Ami。

5.根据权利要求1~4任一项所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述腈水解酶由含腈水解酶的湿菌体细胞提供,所述酰胺酶由含酰胺酶的湿菌体细胞提供;所述含腈水解酶与酰胺酶的湿菌体细胞的质量比为1~12:1。

6.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述外消旋异丁基丁二腈的浓度为10~150g/L。

7.根据权利要求5或6所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述含酰胺酶的湿菌体细胞与外消旋异丁基丁二腈的质量比为0.05~

0.15:1。

8.根据权利要求5所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞的制备方法,包括:(1)设计含酶切位点XhoI和XbaI的腈水解酶基因序列,克隆至空载体pET28b,获得重组质粒,回收后转化至大肠杆菌,培养检测阳性菌,得到腈水解酶基因工程菌;或,设计含有EcoRI和NcoI位点的酰胺酶基因序列,克隆至空载体pET28b,构建表达载体,热击转化到大肠杆菌,培养检测阳性菌,得到酰胺酶基因工程菌;

(2)将腈水解酶基因工程菌/酰胺酶基因工程菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中,25~37℃,100~200rpm,培养6~8h后,得菌体种子液;

将上述菌体种子液以2%的体积比转接至新鲜的含卡那霉素的LB液体培养基中,25~

37℃,100~200rpm,培养至菌体OD600为0.6~0.8时,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷,

25~30℃、100~150rpm发酵10~12h,收集发酵液于0~5℃,6000~9000rpm的条件下离心

10~15min,生理盐水洗涤菌体后,得到含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞;

所述卡那霉素的浓度为30~60mg/L;

所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.05~0.2mM。

9.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的反应介质由纯水或缓冲体系组成。

10.根据权利要求9所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的缓冲体系为磷酸钠缓冲液体系、Tris-HCl缓冲液体系或Gly-NaOH缓冲液体系,所述缓冲液体系的pH范围为6.0~11.0。