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专利号: 201810457895X
申请人: 陕西师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种产番茄红素类球红细菌工程菌的构建方法,其特征在于:用深红红螺菌来源的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtI4无痕替换类球红细菌内源的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3,并敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtC和6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf,然后在敲除zwf的位置整合表达类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs,得到产番茄红素类球红细菌工程菌。

2.根据权利要求1所述的产番茄红素类球红细菌工程菌的构建方法,其特征在于用深红红螺菌来源的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtI4无痕替换类球红细菌内源的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3的方法为:以深红红螺菌ATCC 11170的基因为模板,利用引物crtI4-F和crtI4-R,用保真酶Pfu PCR扩增深红红螺菌ATCC 11170的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtI4;以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板,利用引物crtI4-up-F和crtI4-up-R,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3的上游同源臂,利用引物crtI4-down-F和crtI4-down-R,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3的下游同源臂;利用引物crtI4-up-F与crtI4-R,用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtI3基因的上游同源臂与crtI4基因,再利用引物crtI4-up-F与crtI4-down-R,用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtI3基因的下游同源臂,实现crtI3基因的上游同源臂-crtI4基因-crtI3基因的下游同源臂这三个基因片段的连接,得到△crtI3::crtI4片段;将△crtI3::crtI4片段插入到pK18mobsacB质粒的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点,获得质粒pK18-△crtI3::crtI4,该质粒热激转化进入S17-1感受态,得到供体菌株S17-1Com△crtI3::crtI4,以类球红细菌为受体菌株进行双亲接合,得到菌株RL;

上述各引物序列如下:

crtI4-up-F:CCGGAATTCCTCTCGTCGGCCATCTTG

crtI4-up-R:GAGTTTCATGGCGCGAACTCCTGC

crtI4-F:GTTCGCGCCATGAAACTCCACCCAGCG

crtI4-R:GGCAATCATTTAGACCAGGACCGAGGC

crtI4-down-F:CCTGGTCTAAATGATTGCCTCTGCCGATC

crtI4-down-R:CCCCAAGCTTCGCCCGAGAAACTGTCGTAG。

3.根据权利要求2所述的产番茄红素类球红细菌工程菌的构建方法,其特征在于敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtC的方法为:以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板,利用引物crtC-up-F和crtC-up-R,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的链孢红素羟基化酶基因crtC的上游同源臂,利用引物crtC-down-F和crtC-down-R,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的链孢红素羟基化酶基因crtC的下游同源臂;利用引物crtC-up-F与crtC-down-R,用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtC基因的上游同源臂与下游同源臂,得到△crtC片段;将△crtC片段插入到pK18mobsacB质粒的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点,获得质粒pK18-△crtC,该质粒热激转化进入S17-1感受态,得到供体菌株S17-1 Com△crtC,以RL为受体菌株进行双亲接合,得到基础菌株RL1;

上述各引物序列如下:

crtC-up-F:CCGGAATTCTCATCATGAACGGACCGCC

crtC-up-R:GGGATGTCAGGAAAAGGACACGCCGTCGATATACCA

crtC-down-F:ATCGACGGCGTGTCCTTTTCCTGACATCCCGGCC

crtC-down-R:CCCCAAGCTTGCCTTCAACACGCTCTGGAC。

4.根据权利要求3所述的产番茄红素类球红细菌工程菌的构建方法,其特征在于敲除类球红细菌内源的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的方法为:以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板,利用引物zwf-up-F1和zwf-up-R1,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的上游同源臂,利用引物zwf-down-F1和zwf-down-R1,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的下游同源臂;利用引物zwf-up-F1与zwf-down-R1,用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的上游同源臂与下游同源臂,得到△zwf片段;将△zwf片段插入到pK18mobsacB质粒的XbaⅠ和HindⅢ双酶切位点,获得质粒pK18-△zwf,该质粒热激转化进入S17-1感受态,得到供体菌株S17-1 Com△zwf,以RL1为受体菌株进行双亲接合,得到基础菌株RL2;

上述各引物序列如下:

zwf-up-F1:CTAGTCTAGATGATCGAGATGGCGGGAGG

zwf-up-R1:GGCCTCTCAGCGGATAACCATGGGCTCTCCCGC

zwf-down-F1:GGAGAGCCCATGGTTATCCGCTGAGAGGCCGCCG

zwf-down-R1:CCCCAAGCTTGGTGATGAGGACATGGATGGC。

5.根据权利要求4所述的产番茄红素类球红细菌工程菌的构建方法,其特征在于在敲除zwf的位置整合表达类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs的方法为:以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板,利用引物dxs-F和dxs-R,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs,利用引物zwf-up-F2和zwf-up-R2,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的上游同源臂,利用引物zwf-down-F2和zwf-down-R2,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的下游同源臂;利用引物zwf-up-F2与dxs-R,用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的上游同源臂与dxs基因,再利用引物zwf-up-F2与zwf-down-R2,用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的下游同源臂,实现zwf基因的上游同源臂-dxs基因-zwf基因的下游同源臂这三个基因片段的连接,得到△zwf::dxs片段;将△zwf::dxs片段插入到pK18mobsacB质粒的XbaⅠ和HindⅢ双酶切位点,获得质粒pK18-△zwf::dxs,该质粒热激转化进入S17-1感受态,得到供体菌株S17-1 Com△zwf::dxs,以RL2为受体菌株进行双亲接合,得到产番茄红素类球红细菌工程菌;

上述各引物序列如下:

zwf-up-F2:CTAGTCTAGATGATCGAGATGGCGGGAGGC

zwf-up-R2:GTCGGTCATGGGCTCTCCCGCTGCCT

dxs-F:GAGAGCCCATGACCGACAGACCCTGCAC

dxs-R:GGCGGCCTCTTCCGATCGCCCTCCTC

zwf-down-F2:CGATCGGAAGAGGCCGCCGGGC

zwf-down-R2:CCCCAAGCTTGGTGATGAGGACATGGATGGC。

6.权利要求1的构建方法得到的产番茄红素类球红细菌工程菌株。