1.一种产番茄红素类球红细菌工程菌的构建方法,其特征在于:用深红红螺菌来源的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtI4无痕替换类球红细菌内源的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3,并敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtC和6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf,然后在敲除zwf的位置整合表达类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs,得到产番茄红素类球红细菌工程菌。
2.根据权利要求1所述的产番茄红素类球红细菌工程菌的构建方法,其特征在于用深红红螺菌来源的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtI4无痕替换类球红细菌内源的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3的方法为:以深红红螺菌ATCC 11170的基因为模板,利用引物crtI4-F和crtI4-R,用保真酶Pfu PCR扩增深红红螺菌ATCC 11170的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtI4;以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板,利用引物crtI4-up-F和crtI4-up-R,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3的上游同源臂,利用引物crtI4-down-F和crtI4-down-R,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3的下游同源臂;利用引物crtI4-up-F与crtI4-R,用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtI3基因的上游同源臂与crtI4基因,再利用引物crtI4-up-F与crtI4-down-R,用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtI3基因的下游同源臂,实现crtI3基因的上游同源臂-crtI4基因-crtI3基因的下游同源臂这三个基因片段的连接,得到△crtI3::crtI4片段;将△crtI3::crtI4片段插入到pK18mobsacB质粒的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点,获得质粒pK18-△crtI3::crtI4,该质粒热激转化进入S17-1感受态,得到供体菌株S17-1Com△crtI3::crtI4,以类球红细菌为受体菌株进行双亲接合,得到菌株RL;
上述各引物序列如下:
crtI4-up-F:CCGGAATTCCTCTCGTCGGCCATCTTG
crtI4-up-R:GAGTTTCATGGCGCGAACTCCTGC
crtI4-F:GTTCGCGCCATGAAACTCCACCCAGCG
crtI4-R:GGCAATCATTTAGACCAGGACCGAGGC
crtI4-down-F:CCTGGTCTAAATGATTGCCTCTGCCGATC
crtI4-down-R:CCCCAAGCTTCGCCCGAGAAACTGTCGTAG。
3.根据权利要求2所述的产番茄红素类球红细菌工程菌的构建方法,其特征在于敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtC的方法为:以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板,利用引物crtC-up-F和crtC-up-R,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的链孢红素羟基化酶基因crtC的上游同源臂,利用引物crtC-down-F和crtC-down-R,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的链孢红素羟基化酶基因crtC的下游同源臂;利用引物crtC-up-F与crtC-down-R,用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtC基因的上游同源臂与下游同源臂,得到△crtC片段;将△crtC片段插入到pK18mobsacB质粒的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点,获得质粒pK18-△crtC,该质粒热激转化进入S17-1感受态,得到供体菌株S17-1 Com△crtC,以RL为受体菌株进行双亲接合,得到基础菌株RL1;
上述各引物序列如下:
crtC-up-F:CCGGAATTCTCATCATGAACGGACCGCC
crtC-up-R:GGGATGTCAGGAAAAGGACACGCCGTCGATATACCA
crtC-down-F:ATCGACGGCGTGTCCTTTTCCTGACATCCCGGCC
crtC-down-R:CCCCAAGCTTGCCTTCAACACGCTCTGGAC。
4.根据权利要求3所述的产番茄红素类球红细菌工程菌的构建方法,其特征在于敲除类球红细菌内源的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的方法为:以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板,利用引物zwf-up-F1和zwf-up-R1,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的上游同源臂,利用引物zwf-down-F1和zwf-down-R1,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的下游同源臂;利用引物zwf-up-F1与zwf-down-R1,用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的上游同源臂与下游同源臂,得到△zwf片段;将△zwf片段插入到pK18mobsacB质粒的XbaⅠ和HindⅢ双酶切位点,获得质粒pK18-△zwf,该质粒热激转化进入S17-1感受态,得到供体菌株S17-1 Com△zwf,以RL1为受体菌株进行双亲接合,得到基础菌株RL2;
上述各引物序列如下:
zwf-up-F1:CTAGTCTAGATGATCGAGATGGCGGGAGG
zwf-up-R1:GGCCTCTCAGCGGATAACCATGGGCTCTCCCGC
zwf-down-F1:GGAGAGCCCATGGTTATCCGCTGAGAGGCCGCCG
zwf-down-R1:CCCCAAGCTTGGTGATGAGGACATGGATGGC。
5.根据权利要求4所述的产番茄红素类球红细菌工程菌的构建方法,其特征在于在敲除zwf的位置整合表达类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs的方法为:以类球红细菌ATH 2.4.1的基因为模板,利用引物dxs-F和dxs-R,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs,利用引物zwf-up-F2和zwf-up-R2,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的上游同源臂,利用引物zwf-down-F2和zwf-down-R2,用保真酶Pfu PCR扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的下游同源臂;利用引物zwf-up-F2与dxs-R,用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的上游同源臂与dxs基因,再利用引物zwf-up-F2与zwf-down-R2,用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的zwf基因的下游同源臂,实现zwf基因的上游同源臂-dxs基因-zwf基因的下游同源臂这三个基因片段的连接,得到△zwf::dxs片段;将△zwf::dxs片段插入到pK18mobsacB质粒的XbaⅠ和HindⅢ双酶切位点,获得质粒pK18-△zwf::dxs,该质粒热激转化进入S17-1感受态,得到供体菌株S17-1 Com△zwf::dxs,以RL2为受体菌株进行双亲接合,得到产番茄红素类球红细菌工程菌;
上述各引物序列如下:
zwf-up-F2:CTAGTCTAGATGATCGAGATGGCGGGAGGC
zwf-up-R2:GTCGGTCATGGGCTCTCCCGCTGCCT
dxs-F:GAGAGCCCATGACCGACAGACCCTGCAC
dxs-R:GGCGGCCTCTTCCGATCGCCCTCCTC
zwf-down-F2:CGATCGGAAGAGGCCGCCGGGC
zwf-down-R2:CCCCAAGCTTGGTGATGAGGACATGGATGGC。
6.权利要求1的构建方法得到的产番茄红素类球红细菌工程菌株。