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专利号: 2018106132591
申请人: 浙江农林大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.PLA2抑制剂编码基因的克隆方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一,从中华大蟾蜍皮肤cDNA文库中克隆获得的SEQ ID No.1、SEQ ID No.3,并将SEQ ID No.1翻译得到氨基酸序列 SEQ ID No.2,将SEQ ID No.3翻译得到氨基酸序列为 SEQ ID No.4;

步骤二,采用PCR扩增:

(1)PCR的模板为中华大蟾蜍第一链cDNA;PCR的引物:上游引物序列:5′‑GGATTTGGTCCACTGCAAAC‑3′,下游引物序列:5′‑CTGACAACCGGAGACACAG‑3′,浓度均为2 pmol/μL;

(2)PCR反应体系为30μL,其中10×Buffer:3μL;10 mmol/L dNTPS:1.5μL;上、下游引物各1.5μL;模板DNA:0.2μL;5 U/μL Taq:0.3μL;灭菌纯水21.7μL;

(3)Taq DNA聚合酶PCR扩增中华大蟾蜍PLI基因片段的PCR程序:95℃变性/20 s,58℃退火/20 s,72℃延伸反应/1 min 30 s,40 个循环。

2.根据权利要求1所述的PLA2抑制剂编码基因的克隆方法,其特征在于:步骤一中的cDNA来自于中华大蟾蜍的皮肤、脑、心、肝、肺、胰、胃、肠、肾、精巢、输卵管、脾中的任一部位。

3.根据权利要求1或2所述的PLA2抑制剂编码基因的克隆方法,其特征在于:克隆过程所列基因序列、基因序列翻译的氨基酸、基因序列翻译的氨基酸所构成的蛋白多肽均可应用于抑制剂的制备。

4.PLA2抑制剂编码基因的克隆方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一,从日本蟾蜍皮肤cDNA文库中克隆获得的SEQ ID No.5,并将SEQ ID No.5翻译得到氨基酸序列为 SEQ ID No.6;

步骤二,采用PCR扩增:

(1)PCR的模板为日本蟾蜍第一链cDNA;PCR的引物:上游引物序列:5′‑GGATTTGGTCCACTGCAAAC‑3′,下游引物序列:5′‑CTGACAACCGGAGACACAG‑3′,浓度均为2 pmol/μL;

(2)PCR反应体系为30μL,其中10×Buffer:3μL;10 mmol/L dNTPS:1.5μL;上、下游引物各1.5μL;模板DNA:0.2μL;5 U/μL Taq:0.3μL;灭菌纯水21.7μL;

(3)Taq DNA聚合酶PCR扩增日本蟾蜍PLI基因片段的PCR程序:95℃变性/20 s,58℃退火/20 s,72℃延伸反应/1 min 30 s,40 个循环。

5.根据权利要求4所述的PLA2抑制剂编码基因的克隆方法,其特征在于:步骤一中的cDNA来自于日本蟾蜍的皮肤、脑、心、肝、肺、胰、胃、肠、肾、精巢、输卵管、脾中的任一部位。

6.根据权利要求4或5所述的PLA2抑制剂编码基因的克隆方法,其特征在于:克隆过程所列基因序列、基因序列翻译的氨基酸、基因序列翻译的氨基酸所构成的蛋白多肽均可应用于抑制剂的制备。