1.一种基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒,其特征在于,该试剂盒的内容物组成如下:
96孔ELISA酶标板;
包被抗体,该包被抗体是由针对人proGRP中30‑41aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体EP1‑1以及针对人proGRP中69‑80aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体EP2‑3和EP2‑4组成的混合物,混合比例为2:1:1,工作总浓度为20μg/mL;
人proGRP标准蛋白,该人proGRP标准蛋白通过真核蛋白纯化的方法获得;
生物素标记的检测抗体,该生物素标记的EP3‑1‑biotin,是针对人proGRP中83‑94aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体,工作浓度为5μg/mL;
Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、底物液和终止液;其中:
所述的包被缓冲液为0.05M的碳酸盐缓冲液,pH为9.6;
所述封闭液为含体积分数为10%小牛血清的磷酸盐缓冲液,pH为7.4;
所述样品及检测抗体稀释液为含体积分数为1%小牛血清的磷酸盐缓冲液,pH为7.4;
所述ELISA酶标板洗涤液为含体积分数为0.10%Tween‑20的磷酸盐缓冲液,pH为7.4;
所述底物液为TMB;
所述终止液为摩尔浓度为2M的浓硫酸溶液;
所述的Avidin与HRP的交联蛋白是采用过碘酸钠法获得。
2.如权利要求1所述的基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒,其特征在于,所述的过碘酸钠方法是将HRP与过碘酸钠反应,获得活化的HRP,然后Avidin与活化的HRP反应,得到Avidin与HRP的交联蛋白。
3.权利要求1或2所述的基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒的构建方法,其特征在于,运用蛋白质三维结构预测软件预测proGRP的线性表位EP1:30‑41aa;EP2:
69‑80aa;EP3:83‑94aa,用偶联多肽的方法进行小鼠免疫;所述多肽偶联方法其一是通过原核表达融合HBV‑C/表位小肽蛋白增强小肽的免疫原性;其二是通过使用表位小肽修饰Ad5腺病毒E1区与Hexon区增强其免疫原性;其三是通过融合蛋白与修饰腺病毒交叉免疫小鼠,产生针对特定抗原表位的抗体。
4.权利要求1或2所述的基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒用于制备小细胞肺癌病人的血清学检测试剂盒的应用,所述小细胞肺癌病人的血清学检测是检测重组的proGRP蛋白以及天然的人proGRP蛋白;
检测重组的proGRP蛋白以及天然的人proGRP蛋白具体步骤包括:(1)包被ELISA酶标板:用包被缓冲液将包被抗体EP1‑1、EP2‑3和EP2‑4按比例稀释成20μg/mL,100μL/孔,4℃过夜;
(2)封闭:甩去孔中液体,加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液,洗涤3‑5次后,加入200μL/孔的封闭液,37℃、2h后,洗涤3‑5次,并甩干;
(3)加待检测样品:向所述酶标板中加入待检测样品,100μL/孔,37℃、1h后,洗涤3‑5次,并甩干;
(4)加检测抗体:向所述酶标板中加入检测抗体EP3‑1‑biotin,100μL/孔,37℃、1h后,洗涤3‑5次,并甩干;
(5)加Avidin与HRP的交联蛋白:向所述酶标板中加入Avidin与HRP的交联蛋白,100μL/孔,37℃、1h后,洗涤5‑6次,并甩干;
(6)化学发光:向所述酶标板中加入显色液,100μL/孔;
(7)显色:加入显色液后,37℃避光显色5分钟,置于酶标仪中检测450nm吸光值。