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专利号: 2018107320441
申请人: 南宁师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-11-18
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.用于检测二价汞离子的生物工程菌,其特征在于,所述生物工程菌含有表达载体merR op-ompA-rfp-pSB1A2,其中,merR op-ompA-rfp为重组基因,pSB1A2为质粒骨架。

2.如权利要求1所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤一、利用PCR扩增反应分别实现merR op、ompA、rfp基因片段的扩增,将扩增后的merR op基因片段和ompA基因片段通过重叠延伸PCR技术连接,并通过PCR扩增反应实现扩增,得到目的基因片段merR op-ompA;

步骤二、使用限制性内切酶XbaI和SpeI对pSB1A2质粒骨架和目的基因片段merR op-ompA进行双酶切,使目的基因片段merR op-ompA和pSB1A2质粒骨架同时露出相同的粘性末端,通过T4 DNA连接酶将目的基因片段merR op-ompA和pSB1A2质粒骨架连接,实现merR op-ompA-pSB1A2质粒的构建;

步骤三、使用限制性内切酶SpeI对merR op-ompA-pSB1A2质粒和扩增后的rfp基因片段进行单酶切,再用T4 DNA连接酶将merR op-ompA-pSB1A2质粒和扩增后的rfp基因片段连接,完成表达载体merR op-ompA-rfp-pSB1A2的构建;

步骤四、通过化学转化法将表达载体merR op-ompA-rfp-pSB1A2转化至感受态细胞内,获得所述生物工程菌。

3.如权利要求2所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,步骤一中的目的基因片段merR op-ompA具体通过以下方法获得:分别以全合成的merR op、ompA、rfp基因序列为模板,进行第一次PCR扩增反应,再将扩增后的merR op和ompA基因片段末端的互补片段通过重叠延伸PCR技术实现merR op和ompA的连接,得到连接片段merR op-ompA,进行第二次PCR扩增反应,实现连接片段merR op-ompA的扩增,得到目的基因片段merR op-ompA。

4.如权利要求2所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,步骤四中的感受态细胞为E.coli DH5α感受态细胞。

5.如权利要求3所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,第一次PCR扩增反应时,merR op需要加入的引物包括ImeR-OP XF、OP-ompA UP,ompA需要加入的引物包括OP-ompADN、OmpASR,rfp需要加入的引物包括mRFP1SF、mRFP1SR;第二次PCR扩增反应加入的引物包括IMerR-OP XF和OmpASR。

6.如权利要求2所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,步骤二中进行双酶切时的反应温度为37℃,反应时间为1h。

7.如权利要求2所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,步骤三中进行单酶切时的反应温度为37℃,反应时间为1h。

8.如权利要求3所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,第一次PCR扩增反应包括30个循环,其中,一个循环依次包括98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸5s;第二次PCR扩增反应包括30个循环,其中,一个循环依次包括98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸10s。

9.如权利要求1所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的用途,其特征在于,该生物工程菌用于检测水环境是否含有Hg2+。

10.如权利要求9所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的用途,其特征在于,该生物工程菌识别Hg2+的反应时间为15min以上。