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专利号: 2018107748721
申请人: 天津农学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GPR.1,其组成如下:溶液GPR.1A:2~3.5%PEG8000,0.5M NaCl,0.1M Tris-HCl,0.05M EDTA,2~4%PVPP临用前加入,余量为双蒸水;

溶液GPR.1D:18~20%PEG8000,3.3~3.6M NaCl,余量为双蒸水;

溶液GNR.1E:50mM Tris-HCl,10mM EDTA,2.5M NaCl,余量为双蒸水;

还包括:

20mg/mL蛋白酶K,使用时单独加入;

20%SDS,使用时单独加入;

5M乙酸钾溶液,使用时单独加入。

2.如权利要求1所述的一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GPR.1,其特征在于,所述Tris-HCl是pH 8.0的Tris-HCl溶液。

3.如权利要求1所述的一种高效提取植物基因组DNA的无毒提取液组合GPR.1,其特征在于,所述EDTA是pH 8.0的EDTA溶液。

4.权利要求1或2或3所述的无毒提取液组合GPR.1应用于提取植物基因组DNA的用途。

5.一种基于权利要求1或2或3所述的无毒提取液组合GPR.1提取植物基因组DNA的方法,其特征在于:利用GPR.1A与蛋白酶K结合的SDS抽提缓冲液在65℃下裂解植物细胞,使染色体离析,蛋白质变性,释放出核酸;加入乙酸钾去除大部分蛋白质和多糖的沉淀后,采用GPR.1D和乙醇/GNR.1E连续两次沉淀DNA,去除多糖类、多酚类等杂质,得到大量高纯度的DNA。

6.如权利要求5所述的提取植物基因组DNA的方法,其特征在于,在第二次沉淀DNA之前加入少量RNase A,去除RNA影响。

7.如权利要求6所述的提取植物基因组DNA的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)取植物叶片,于液氮中研磨成细粉,迅速转入2mL离心管中,按每150mg±50mg植物叶片加入1000μL溶液GPR.1A,剧烈摇匀;再加入65μL 20%SDS与5~6μL 20mg/mL蛋白酶K贮液,轻缓颠倒摇匀;65℃保温30min,不时轻缓颠倒摇匀;

(2)加入离心管三分之一体积的5M乙酸钾溶液,65℃保温1min,立即轻缓颠倒摇匀;4℃或冰上静置20min;4℃,20000×g,离心20min,完成后置冰上;

(3)取上清液约1000μL,转入装有二分之一体积的溶液GPR.1D的1.5mL离心管中,轻缓颠倒摇晃30次以上直至混匀,4℃静置25min。4℃,4000~5000×g,离心15min,弃上清;短暂离心,用吸头轻缓吸尽残留液体;

(4)加入0.1×TE(pH 8.0)200μL和10mg/mL RNase A贮液2μL,轻缓摇晃至沉淀完全消失,65℃保温15min;加入300μL的溶液GPR.1E,混匀;4℃,20000×g,离心10min,完成后置冰上;

(5)取上清液450μL,转入装有1000μL-20℃预冷的无水乙醇的1.5mL离心管中,仔细混匀,4℃静置20min;4℃,13000~14000g,离心10min,弃上清;

(6)加入70%乙醇1000μL,轻缓颠倒摇匀几次,4℃,13000~14000g,离心5min,弃上清;

短暂离心,吸尽残留液体;加入30μL的0.1×TE(pH 8.0)溶液,轻弹至DNA沉淀完全消失,65℃保温15min,-20℃贮存备用。