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专利号: 2018108159673
申请人: 曲阜师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种生物样本中微量雷公藤甲素含量的检测分析方法,其特征在于:所述雷公藤甲素与衍生试剂d0-/d3-3-N-甲基-2’-羧基罗丹明6G(d0-/d3-MCR6G)发生稳定同位素标记衍生化反应,磁性分子印迹聚合物特异性萃取后得到的衍生化产物经滤膜过滤后,利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱分析系统进行检测。

2.根据权利要求1所述的检测分析方法,其特征在于,具体包括以下步骤:

a. 微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取:取50-100 μL预处理的待测样品或雷公藤甲素标准品溶液,25 μL CMPI和25 μL DMAP乙腈溶液加入离心管中,涡旋10秒后,加入150-300 μL d0-MCR6G或d3-MCR6G乙腈溶液,摇匀后密封并在在微波反应器中反应6-7分钟,d0-MCR6G标记的待测样品和d3-MCR6G标记的标准品1:1(V/V)混合,摇匀;将5-15 mg磁性固体吸附剂分散到上述混合溶液中,振荡60分钟,磁性分离,用解吸溶剂将同位素标记衍生物从吸附剂上解吸下来,磁性分离,氮气吹干,残余物用200-300 μL甲醇溶解,得到雷公藤甲素同位素标记衍生物萃取溶液;

b. 将雷公藤甲素同位素标记衍生物萃取溶液经滤膜过滤,利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。

3.根据权利要求2所述的检测分析方法,其特征在于,所述CMPI乙腈溶液的浓度为5-10 wt%;所述DMAP乙腈溶液的浓度为10-20 wt%;所述d0-MCR6G或d3-MCR6G乙腈溶液浓度均为

1.0×10-3 mol/L;所述微波反应器的功率为800-870 W,在微波反应器中反应的温度为55-

65 °C;所述雷公藤甲素标准品溶液浓度介于3-5000pg/mL。

4.根据权利要求3所述的检测分析方法,其特征在于,所述微波反应器的功率为850 W,反应的温度为60 °C。

5.根据权利要求2或3所述的检测分析方法,其特征在于,所述磁性固体吸附剂为以SiO2@Fe3O4为载体、以d0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物为模板分子的磁性分子印迹聚合物;所述解析溶剂为含10 %乙酸的甲醇、乙腈、乙醇或丙酮;所述解吸溶剂最优化的为含10 %乙酸的甲醇。

6.根据权利要求2或5所述的检测分析方法,其特征在于,所述磁性固体吸附剂采用以下方法制备而成:

(1)磁性Fe3O4的制备:磁力搅拌下将5.40 g FeCl3溶解于200 mL乙二醇中,40 min后得清澈黄色溶液,然后加入14.80 g乙酸钠,继续搅拌40 min;将搅拌好的混合液转移至400 mL的聚四氟乙烯不锈钢高压反应釜中,密封后在烘箱内200℃下反应8 h,反应结束后自然冷却,在外加磁铁下收集黑色磁性纳米微球,用水和乙醇分别洗三次,放入真空烘箱60 ℃下干燥12 h;

(2)磁性Fe3O4的修饰:300 mg磁性 Fe3O4分散到50.0 mL异丙醇中,加入4.0 mL纯水超声

15.0 min,然后加入5.0 mL氨水和2.0 mL 四乙氧基硅烷,室温下持续搅拌反应12 h,在外磁铁作用下收集反应获得的Fe3O4@SiO2,利用高纯水清洗,然后放入45 ℃真空烘箱中干燥

24 h,称取200 mg干燥的Fe3O4@SiO2颗粒分撒于50.0 mL甲醇中,超声10.0 min,搅拌下逐滴加入 3.0 mL 3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯,室温下搅拌反应24 h,在外加磁铁下收集乙烯基修饰的Fe3O4@SiO2,利用甲醇清洗后放入45 ℃真空烘箱内干燥24 h;

(3)磁性核壳分子印迹材料的制备:0.1 mmol d0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物和0.4 mmol 丙烯酰胺溶解于10.0 mL乙腈中,超声15.0 min,暗处理12 h形成预聚合溶液,100 mg 乙烯基修饰的Fe3O4@SiO2,2.0 mmol 二甲基丙烯酸乙二醇酯 和20 mg 偶氮二异丁腈均匀分散入预聚合溶液中,超声15.0 min得混合液,将混合液加入含有70.0 mL乙腈溶液的三口烧瓶中,氮气净化,搅拌下60 ℃反应24 h,在外磁铁作用下收集磁性核壳分子印迹材料颗粒,利用甲醇/乙酸(9:1, v:v)进行索氏提取除去模板分子,获得的产物放入45 ℃真空烘箱中干燥24 h即得。

7.根据权利要求1-6任一项所述的检测分析方法,其特征在于,所述d0-/d3-MCR6G采用以下方法制备而成:将1g罗丹明6G溶于30mLDMF中,室温下搅拌5分钟后,缓慢加入

0.217gNaH反应3分钟,然后在3-5分钟内加入330 μL CH3I或CD3I,室温下反应150分钟后,加入150 mL水终止反应;用150 mL氯仿萃取混合物两次,合并有机层并减压蒸馏得粗产物,经甲醇/氯仿(1:1, V/V)重结晶,得到产物d0-MCR6G或d3-MCR6G。

8.根据权利要求7所述的检测分析方法,其特征在于,所述NaH加入时以煤油作为载体;

所述NaH在煤油中的质量百分含量为60%。

9.根据权利要求1-6任一项所述的检测分析方法,所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱:2.1 mm × 50 mm,1.8 µm,进样体积为2 µL,柱温30 °C,采用梯度洗脱法;所述质谱的条件为:干燥气温度310 °C,流速12 L/min,喷雾器气压40 psi,鞘气温度300 °C,流速11 L/min,毛细管电压3.5 kV,扫描方式为多反应监测模式,质谱检测的前1.0分钟流动相进废液,1.0-3.0分钟进入电离源。

10.根据权利要求9所述的检测分析方法,其特征在于,所述梯度洗脱法:时间为3.0 min,流速为0.2 mL/min,流动相A为20%甲醇水溶液含有0.1%甲酸,流动相B为含有0.1%甲酸的甲醇,0 min流动相组成为70% A+30% B,1 min时30% A+70% B,2.0 min时2% A+98% B,

3.0 min时2% A+98% B。