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专利号: 2018108454602
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种产O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸的重组大肠杆菌,其特征在于所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌Ecoli W3110中编码L‑蛋氨酸运输蛋白的metI基因、编码负调控阻遏因子的metJ基因、编码胱硫醚γ合成酶的metB基因、编码高丝氨酸激酶的thrB基因依次敲除后,再分别将编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因、编码高丝氨酸脱氢酶II的metL基因和编码α‑酮戊二酸脱羧酶的sucA基因的启动子均替换为Ptrc启动子,最后再导入编码高丝氨酸转琥珀酰基酶的metA突变基因和编码L‑蛋氨酸外运蛋白的yjeH基因,所述metA突变基因是将metA基因编码蛋白第64位谷氨酸替换为谷氨酰胺获得的;所述Ptrc启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.21所示。

2.如权利要求1所述产O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸的重组大肠杆菌,其特征在于所述metI基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示、metJ基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示、metB基因核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示、thrB基因核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。

3.如权利要求1所述产O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸的重组大肠杆菌,其特征在于所述yjeH基因核苷酸序列为SEQ ID NO.17所示、metA基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.16所示。

4.一种权利要求1所述产O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸的重组大肠杆菌在发酵产O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸中的应用。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述应用是将所述的重组大肠杆菌接种至发酵培养基,在30℃、180‑200rpm条件下发酵培养,将培养液分离纯化,获得O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述发酵培养基终浓度组成为:葡萄糖40/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵17g/L、酵母粉4g/L、碳酸钙30g/L、L‑苏氨酸0.2g/L、L‑蛋氨酸

0.2g/L、L‑异亮氨酸0.2g/L、维生素B1 0.0001g/L、MgSO4 2g/L、FeSO4 0.005g/L、MnSO40.005g/L、ZnSO4 0.005g/L,溶剂为去离子水,pH值6.8。

7.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述发酵培养前先进行斜面活化和种子培养,将种子液以体积浓度5‑10%的接种量接种至发酵培养基,所述斜面活化方法为:将重组大肠杆菌接种在LB平板上,在37℃培养过夜,获得斜面菌体;所述种子培养方法为:挑取斜面菌体单菌落接种至LB培养基中,在37℃、200rpm的条件下培养过夜,获得种子液。

8.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述发酵培养在发酵罐中进行,通过添加补料培养基控制发酵罐中葡萄糖浓度2‑10g/L;发酵条件为DO水平在30%,搅拌转速200‑

600rpm,通气速率控制在1‑2vvm;发酵过程中控制培养温度在30℃并用50%的氨水调节pH6.8~7.0;发酵罐中发酵培养基组成:葡萄糖40g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵17g/L、酵母粉4g/L、L‑苏氨酸0.2g/L、L‑蛋氨酸0.2g/L、L‑异亮氨酸0.2g/L、MgSO4 2g/L、FeSO40.005g/L、MnSO4 0.005g/L、ZnSO4 0.005g/L、维生素B1 0.0001g/L,溶剂为去离子水,pH值6.8;补料培养基组成:葡萄糖500g/L、磷酸二氢钾12.5g/L、L‑苏氨酸2g/L、L‑蛋氨酸2g/L、L‑异亮氨酸2g/L,溶剂为去离子水。

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