1.一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)摇瓶种子液:取保存于固体斜面的海洋细菌菌株(Nioella sp.)LZ7-4接种于装有无菌培养液的1L锥形三角瓶中,装液量:200mL,28℃培养12小时,取培养物进行镜检,确认菌体生长良好,无杂菌污染,即可接种于种子罐中;
(2)种子液的准备:按摇瓶种子液的配方配制培养液5L,加入种子罐中,通蒸汽加热,
121℃灭菌28分钟,冷却至28℃,用火焰法接种,将摇瓶种子液接种于种子罐中的种子培养基上,通气量60L/min,搅拌转速150转/min,28℃培养12小时,取培养物进行镜检,确认菌体生长良好,无杂菌污染,即可接种于发酵罐中;
(3)发酵培养:按发酵罐的配方,配制培养液20L,加入50L的发酵罐中,通蒸汽加热,121℃灭菌28分钟,冷却至28℃,将种子液通过管道接种于发酵罐中的发酵培养基上,进行发酵培养,得到含有海葵毒素的发酵液;
(4)发酵液的萃取:将发酵液经板框过滤后得细胞沉淀,加入15L的甲醇水溶液进行产物提取,将提取液通过0.45微米滤膜过滤,对沉淀进行二次提取,得到二次提取液;将二次提取液经0.45微米滤膜过滤后,加入5L的甲醇水溶液进行三次提取,合并三次提取液,旋蒸浓缩,得到粗提物;
(5)粗提物的纯化:将步骤(4)得到的粗提物通过半制备色谱进行梯度洗脱,通过与海葵毒素标准品进行比对,收集海葵毒素组分,旋转蒸发干溶剂,获得白色粉末,即获得海葵毒素。
2.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述种子培养基的成分为:蛋白胨5g,酵母膏1g,磷酸二氢钾0.05g和天然海水
1000mL。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述种子培养基的pH为7.2。
4.根据权利要求3所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(2)中,培养条件为:通气量60L/min,搅拌转速150转/min,培养温度为28℃,培养时间为
12小时。
5.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述发酵培养基的成分为:蛋白胨6g,酵母膏5g,磷酸二氢钾0.2g,氯化钠0.5g,氯化亚铁0.001g,脯氨酸0.002g和天然海水1000mL。
6.根据权利要求1或5所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述发酵培养基的pH为7.2。
7.根据权利要求6所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(3)中,发酵培养的条件为:维持通气量100L/min,搅拌转速150~160转/min,发酵培养培养温度为28℃,发酵培养时间为36~40小时。
8.根据权利要求4或6所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述甲醇水溶液的体积分数为50%。
9.根据权利要求8所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述甲醇水溶液的pH为5.5。