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专利号: 2018108660351
申请人: 浙江海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)摇瓶种子液:取保存于固体斜面的海洋细菌菌株(Nioella sp.)LZ7-4接种于装有无菌培养液的1L锥形三角瓶中,装液量:200mL,28℃培养12小时,取培养物进行镜检,确认菌体生长良好,无杂菌污染,即可接种于种子罐中;

(2)种子液的准备:按摇瓶种子液的配方配制培养液5L,加入种子罐中,通蒸汽加热,

121℃灭菌28分钟,冷却至28℃,用火焰法接种,将摇瓶种子液接种于种子罐中的种子培养基上,通气量60L/min,搅拌转速150转/min,28℃培养12小时,取培养物进行镜检,确认菌体生长良好,无杂菌污染,即可接种于发酵罐中;

(3)发酵培养:按发酵罐的配方,配制培养液20L,加入50L的发酵罐中,通蒸汽加热,121℃灭菌28分钟,冷却至28℃,将种子液通过管道接种于发酵罐中的发酵培养基上,进行发酵培养,得到含有海葵毒素的发酵液;

(4)发酵液的萃取:将发酵液经板框过滤后得细胞沉淀,加入15L的甲醇水溶液进行产物提取,将提取液通过0.45微米滤膜过滤,对沉淀进行二次提取,得到二次提取液;将二次提取液经0.45微米滤膜过滤后,加入5L的甲醇水溶液进行三次提取,合并三次提取液,旋蒸浓缩,得到粗提物;

(5)粗提物的纯化:将步骤(4)得到的粗提物通过半制备色谱进行梯度洗脱,通过与海葵毒素标准品进行比对,收集海葵毒素组分,旋转蒸发干溶剂,获得白色粉末,即获得海葵毒素。

2.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述种子培养基的成分为:蛋白胨5g,酵母膏1g,磷酸二氢钾0.05g和天然海水

1000mL。

3.根据权利要求1或2所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述种子培养基的pH为7.2。

4.根据权利要求3所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(2)中,培养条件为:通气量60L/min,搅拌转速150转/min,培养温度为28℃,培养时间为

12小时。

5.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述发酵培养基的成分为:蛋白胨6g,酵母膏5g,磷酸二氢钾0.2g,氯化钠0.5g,氯化亚铁0.001g,脯氨酸0.002g和天然海水1000mL。

6.根据权利要求1或5所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述发酵培养基的pH为7.2。

7.根据权利要求6所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(3)中,发酵培养的条件为:维持通气量100L/min,搅拌转速150~160转/min,发酵培养培养温度为28℃,发酵培养时间为36~40小时。

8.根据权利要求4或6所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述甲醇水溶液的体积分数为50%。

9.根据权利要求8所述的一种利用海洋细菌发酵制备海葵毒素的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述甲醇水溶液的pH为5.5。