1.一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一、构建pdICP4-promoter质粒:PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株ICP4基因启动子上游和下游的侧翼序列后,用限制性内切酶EcoRI/SpeI分别消化后获得ICP4基因启动子的上游侧翼序列、下游侧翼序列及去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株,并用互补的连接酶Linker 1和Linker 2将所述ICP4基因启动子的上游侧翼序列和下游侧翼序列连接起来,并把连接后的产物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位点创建质粒pdICP4-promoter;
步骤二、构建pdICP4-ALDH1-promoter质粒:用EcoRI/XhoI双酶切消化的方式把由CMV启动子控制的人ALDH1启动子序列从质粒pcDNA3.1-ALDH1-promoter中释放出来,用T4DNA多聚酶处理后克隆入步骤一所得质粒pdICP4-promoter的限制性内切酶EcoHV酶切位点处,从而构建质粒pdICP4-ALDH1-promoter;
步骤三、BHK细胞内同源重组I型单纯疱疹病毒17+株:将步骤一中去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株与步骤二中质粒pdICP4-ALDH1-promoter共同转染BHK细胞,使这两者在BHK细胞发生同源重组,获得表达ALDH1启动子的重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter;
步骤四、构建pdICP34.5质粒:PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株中ICP34.5基因的上游和下游侧翼序列,得到的ICP34.5上游和下游侧翼序列两个片段用重叠PCR进行连接,随后把连接后的产物插入预先用限制性内切酶BamHI/XhoI消化后的质粒pSP72中,用T4DNA多聚酶补平质粒的粘性末端,得到的质粒命名为pdICP34.5;
步骤五、构建质粒pdICP34.5-hIL-12:用hIL-12基因替代质粒pcDNA3.1-ALDH1-promoter中的ALDH1-promoter,产生质粒pcDNA3.1-hIL-12;把来自质粒pcDNA3.1-hIL-12中的hIL-12表达盒克隆入质粒pdICP34.5的Afel位点处,创建质粒pdICP34.5-hIL-12;
步骤六、步骤五中的质粒pdICP34.5-hIL-12用来删除步骤三中重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter中ICP34.5基因,从而构建出溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12。
2.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法,其特征在于,步骤一中的ICP4启动子中,上游侧翼序列的引物对包括:上游序列ICP4-promoterUSf为AAAAGAATTCGATACACATCGTTCAGACGGAGC;
下游序列ICP4-promoterUSr为AAAAACTAGTGATCGATCTCGCACATGGCCT;
下游侧翼 序列的引物对 包括:上游 序列ICP4- promo terDSf 为
AAAAAAGCTTTCACGCGCATGCTCTTCTC;
下游序列ICP4-promoterDSr为AAAACAGCTGCACCGTGCCCGTGATGAA。
3.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法,其特征在于,步骤四中的ICP34.5基因中,上游侧翼序列的引物对包括:上游序列ICP34.5USf为CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG;
下游序列ICP34.5USr为GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGTCCTGACCGCGGG;
下游侧翼序列的引物对包括:上游序列ICP34.5DSf为GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA;
下游序列ICP34.5DSr为TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA。
4.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法,其特征在于,步骤一中,Linker 1的引物序列为CTAGTGAATTCTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCA;
Linker 2的引物序列为AGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGAATTCA。
5.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法,其特征在于,步骤三中重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter通过四轮挑取嗜毒斑的方法进行纯化。
6.一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒,其特征在于,采用下述构建方法:将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上的ICP4基因启动子置换成肿瘤干细胞特异性启动子,再将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上ICP34.5基因剔除并插入IL-12表达序列构建得新型溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12。
7.根据权利要求6所述的一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒,其特征在于,所述肿瘤干细胞特异性启动子为ALDH1启动子。
8.根据权利要求6或7所述的一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒,其特征在于,所述构建方法为权利要求1-5中任一项所述的构建方法。