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专利号: 2018109188550
申请人: 河南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种生物活性肽P11在治疗甲状腺癌的药物中效果分析方法,其特征在于,包括以下步骤:

S1、将人甲状腺癌细胞中的TT、TPC-1、ARO细胞分别分为阴性对照组、P6肽组、P9肽组、P6+P9肽组和P11肽组,每种细胞共5组;

S2、待细胞生长至对数生长期,各组更换为无血清培养基,其中对照组加入PBS,给药组分别加入200μmol/L P6肽,200μmol/L P9肽,200μmol/L P6+P9肽,200μmol/L P11肽,继续培养24h;

S3、通过MTS法、EDU法、蛋白免疫印迹(Western blot)法检测发现,加入200μmol/L的P11肽作用于人甲状腺癌细胞TT、TPC-1、ARO时,抑制细胞生长作用较其他组都强;

S4、通过划痕、迁移(Transwell法)及侵袭(Invasion法)实验检测发现,加入200μmol/L的P11肽作用于人甲状腺癌细胞TT、TPC-1、ARO时,显示出比其他组更强的抑制细胞迁移和侵袭的能力;

S5、通过裸鼠移植瘤实验表明,P11肽具有比其它给药组更强的抑制人甲状腺癌生长的作用。

2.根据权利要求1所述的一种生物活性肽P11在治疗甲状腺癌的药物中效果分析方法,其特征在于:所述S3中的EDU法的具体过程为(1)EDU标记(24孔板操作):用细胞培养基按

1000∶1的比例稀释EDU溶液(试剂A),制备适量50μM EDU培养基;每孔加入300μL50μM EDU培养基孵育2h,弃培养基,PBS清洗细胞2次,每次5min;(2)细胞固定:每孔加入150μL细胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育30min,弃固定液,每孔加入150μL2mg/mL甘氨酸,脱色摇床孵育5min,弃甘氨酸溶液,每孔加入300μL PBS,清洗1次,5min,弃PBS,(加强)每孔加入

100μL渗透剂(0.5%Triton-X100的PBS)脱色摇床孵育10min,PBS清洗1次,5min;(3)Apollo染色:每孔加入300μL的1×Apollo染色反应液(一定要按顺序配,现用现配,30min用完),避光,室温,脱色摇床孵育30min,弃染色反应液,加入300μL渗透剂(0.5%Triton-X100的PBS)脱色摇床清洗2次,每次10min,弃渗透剂,(加强)每孔每次加入300μL甲醇清洗1-2次,每次

5min,PBS洗1次,每次5min;(4)DNA染色:用去离子水按100∶1的比例稀释试剂F,制备适量1×Hoechst33342反应液,避光保存,每孔加入300μL1×Hoechst33342反应液,避光,室温,脱色摇床孵育30min,弃染色反应液,每孔每次加入300μLPBS洗3次,每次5min,每孔加300μLPBS保存,拍照,计数细胞增殖率。

3.根据权利要求2所述的一种生物活性肽P11在治疗甲状腺癌的药物中效果分析方法,其特征在于:所述Apollo染色反应液配制1.5mL的配方为去离子水(A)1407μL、Apollo反应缓冲液(B)75μL、Apollo催化剂溶液(C)15μL、Apollo荧光染料溶液(D)4.5μL、Apollo缓冲添加剂(E)13.5mg。

4.根据权利要求1所述的一种生物活性肽P11在治疗甲状腺癌的药物中效果分析方法,其特征在于:所述S3中的MTS法的具体过程为分别消化计数人甲状腺癌细胞TT、TPC-1、ARO,铺至96孔培养板中,接种量为8×103个/孔,每组设6个副孔,每孔加入100μL培养基,在37℃培养箱中孵育,24h后,每孔分别加入10μL、5mg/mL的MTS溶液,在培养箱中继续培养2h,然后取出细胞,使用酶标仪在490nm处测定各孔的吸光值,根据吸光值计算细胞活力:细胞活力(%of control)=(药物组A值-调零孔A值)/(对照孔A值-调零孔A值)×100%。

5.根据权利要求1所述的一种生物活性肽P11在治疗甲状腺癌的药物中效果分析方法,其特征在于:所述S4中的划痕法的具体过程为分别消化计数人甲状腺癌细胞TT、TPC-1、ARO,铺至6孔培养板中,接种量为5×105个/孔,每孔加入3ml的培养基,培养箱中37℃孵育;

待细胞生长至对数生长期,进行划痕操作,划痕结束后用PBS洗3次,各组更换无血清培养基,其中对照组加入PBS,给药组分别加入200μmol/L P6肽,200μmol/L P9肽,200μmol/L P6+P9肽,200μmol/L P11肽。0h、12h,24h在100×镜下进行拍照。计算细胞迁移率:细胞迁移率(%)=(划痕0h的距离-划痕24h的距离)/划痕0h的距离×100%。

6.根据权利要求1所述的一种生物活性肽P11在治疗甲状腺癌的药物中效果分析方法,其特征在于:所述S4中的迁移(Transwell法)实验的具体过程为将小室置于24孔板中,小室下层加入600μL含20%血清的培养基,上层加入200μL不含血清的培养基,每孔4×104个细胞,37℃培养箱内孵育24h,取出培养板,弃去培养基,每孔加75%酒精固定15min,PBS洗2次,结晶紫染色10min,自来水冲洗,将结晶紫洗去,用棉签将小室上层擦干净,用刀片轻轻刮下薄膜放于载玻片上,用中性树胶固定,100×镜下拍照。

7.根据权利要求1所述的一种生物活性肽P11在治疗甲状腺癌的药物中效果分析方法,其特征在于:所述S4中的侵袭(Invasion法)实验的具体过程为将小室置于24孔板中,小室下层加入600μL含20%血清的培养基,上层加入200μL不含血清的培养基,每孔8×104个细胞,37℃培养箱内孵育24h,取出培养板,弃去培养基,每孔加75%酒精固定15min,PBS洗2次,结晶紫染色10min,自来水冲洗,将结晶紫洗去,用棉签将小室上层擦干净,用刀片轻轻刮下薄膜放于载玻片上,用中性树胶固定,100×镜下拍照。

8.根据权利要求1所述的一种生物活性肽P11在治疗甲状腺癌的药物中效果分析方法,其特征在于:所述Western blot法的具体过程为分别消化计数人甲状腺癌细胞TT、TPC-1、ARO,铺至60mm培养皿中,待细胞生长至对数生长期,各组更换无血清培养基,其中对照组加入PBS,给药组分别加入200μmol/L P6肽,200μmol/L P9肽,200μmol/L P6+P9肽,200μmol/L P11肽,培养24h后提取蛋白,采用Western Blot法检测cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cleaved PARP的蛋白表达情况。

9.根据权利要求1所述的一种生物活性肽P11在治疗甲状腺癌的药物中效果分析方法,其特征在于:所述S5中的裸鼠移植瘤实验的具体过程为将细胞消化计数,用PBS重悬细胞配制成5×106个/mL的细胞悬液,采用1mL注射器取细胞悬液0.2mL注射于裸鼠右侧腋下,接种后24h,分别将接种有人甲状腺癌细胞TT、TPC-1、ARO的裸鼠按体重随机分为5组,每组6只:阴性对照组:(生理盐水),P6肽组(320μg/kg/d),P9肽组(320μg/kg/d),P6肽+P9肽组(320μg/kg/d),P11肽组(320μg/kg/d),各组均采用皮下注射,给药体积按照0.1mL/10g进行,共给药28天,实验期间裸鼠自由进食和饮水,每日测量裸鼠体重及肿瘤的长(a)短(b)径,并按公式:体积=π/6×a×b2计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。裸鼠处死后,取出肿瘤并称重,按下列公式计算肿瘤生长抑制率,肿瘤生长抑制率(Inhibition rate,IR)=(1-给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100%,绘制裸鼠肿瘤体积变化曲线、肿瘤重量、抑瘤率、裸鼠体重变化曲线。