1.一种基于蛋白质组学鉴别古代毛织品残片毛种类的方法,其特征在于,以g和mL计,包括如下步骤:
1)称取等量已混淆的古代山羊毛、绵羊毛、骆驼毛织品,用去离子水反复清洗,去除表面污渍, 30-35℃真空烘干,分别记为A、B、C三组;
2)将步骤1)烘干的A、B、C三组样品,分别浸没在pH =1.5-2.5的草酸溶液中,静置1-2h,用去离子水搓洗至中性,30-35℃真空烘干;
3)将步骤2)烘干的A、B、C三组样品,以1:15-25的浴比加入含有0.05-0.15mol/L LiBr和0.02-0.04mol/L 十二烷基硫酸钠的溶液中浸没,调节pH值到8-11,40-50℃下以190-
210W的功率超声30-50min后,放入微波反应器辐射水解6-8min;
4)从反应器中取出,倒入三口烧瓶,将三口烧瓶放在恒温水浴锅中,调节水浴温度70-
90℃,通氮气10-20分钟,排除氧气,缓缓加入10-25ml的2.5-3.5 mol/L 三(2-羧乙基)膦溶液,通氮气搅拌,使毛溶解,真空抽滤,去除未溶毛及杂质;
5)在4-8℃下,加入无水甲醇,反复浸泡,使蛋白析出,滤出蛋白后,加入去离子水溶解,在2-6℃条件下用透析袋透析,前9-12h,每隔1-2h换一次水,第12- 24h每隔2-5h换一次水,第24-48h每隔5-10h换一次水,第48-72h,每隔10-15h换一次水,除去表面活性剂、金属盐等杂质;低温真空浓缩至原体积的1/4-1/2,得到角蛋白提取液A、B、C;
6)向15-30 m L正己烷中加入摩尔比为18-22:1的水和十二烷基苯磺酸钠,制得油相溶液;
7)向步骤6)所得油相溶液中,加入质量分数为45-55%的生物质焦油水溶液,再加入摩尔比为1.8-2.2:1的正戊醇和十二烷基苯磺酸钠,用力摇晃,溶液变淡黄色,即得到反相微乳液,于室温静置10-13h;
8)向步骤7)所得反相微乳液中加入0.2-0.4 g十二胺,室温下超声8-12 min;然后向含聚四氟乙烯内胆的反应釜内倒入超声后的混合溶液,在110-130℃马弗炉中放置2-4 h,取出,自然冷却至室温;用无水丙醇破乳,洗涤数次,离心,制得碳量子点原始溶液;
9)用柠檬酸将0.02-0.04 mol/L的柠檬酸钠溶液的pH调为2.5-2.8,将此溶液与350-
450μl步骤8)所得碳量子点原始溶液混合均匀,制得碳量子点染胶溶液;
10)组装制胶器,灌注分离胶,加入纯化水,待分离胶的胶面与水形成可见的界面时,轻轻倒出纯化水,擦干纯化水后插上梳子,注入浓缩胶;待浓缩胶完全聚合后,将梳子轻轻拔出;
11)取角蛋白提取液A、B、C于2*样品缓冲液按1∶0.8-1.2比例混合,水浴加热于93-97℃下加热1.5-2.5 min,使蛋白质变性并确保结合最大量的十二烷基硫酸钠;样品冷却至室温后,分别取10-20μl角蛋白提取液A、B、C加入凝胶点样孔,进行SDS-PAGE凝胶电泳;
12)电泳完毕后,切断电源,取出凝胶, 浸入步骤9)所得碳量子点染胶溶液,以低速在摇床上振荡2.5-3.5h,放到凝胶成像仪中,观察样品的电泳图像;
13)将经步骤12)所得的染色样品的蛋白质条带割下来装入1.0-2.0ml离心管中,加入
300-400ul去离子水振荡洗涤,吸出液体,重复一次,加入含10-30%甲醇、4-8%甘油、8-12%乙酸的脱色液40-70ul,静置2-4min,用去离子水终止反应并重复洗涤一次,吸出多余的液体;加入180-220ul 35-45mmol/L碳酸氢铵溶液振荡洗涤2-4min,重复一次;加入110-160 ul乙腈振荡,待胶块变白,吸弃乙腈,置于真空浓缩仪中干燥8-12min;
14)向步骤13)所得的离心管中加入50-80ul的胰蛋白酶溶液,完全盖住胶粒冰浴40-
50min,使胶粒吸收酶解液溶胀,然后在35-40℃烘箱中孵育13-15h进行酶解;
15)采用HPLC-MS/MS对样品A、B、C进行质谱分析,根据质谱检测得到的氨基酸序列与三种毛的氨基酸序列数据库对比,若样品符合山羊毛氨基酸序列,为山羊毛织品;若样品符合绵羊毛氨基酸序列,则为绵羊毛织品;若样品符合骆驼毛氨基酸序列,则为骆驼毛织品。
2.如权利要求1所述的一种基于蛋白质组学鉴别古代毛织品残片毛种类的方法,其特征在于,步骤4)中,所述通氮气搅拌具体为向三口烧瓶中持续通入氮气,利用机械搅拌以
180-220r/min的速度搅拌1.8-2.2 h至毛溶解,溶液变澄清。
3.如权利要求1所述的一种基于蛋白质组学鉴别古代毛织品残片毛种类的方法,其特征在于,步骤5)中,所述透析袋的截留分子量为3500-4000。
4.如权利要求1所述的一种基于蛋白质组学鉴别古代毛织品残片毛种类的方法,其特征在于,步骤11)中,所述样品缓冲液为1.8-2.2ml 0.4-0.6mol/L三(羟甲基)氨基甲烷-HCl, 1.8-2.2ml甘油,1.8-2.2ml 18-22%十二烷基硫酸钠, 0.4-0.6mol 0.08-0.12%溴酚蓝,0.8-1.2ml二硫苏糖醇的混合溶液。
5.如权利要求4所述的一种基于蛋白质组学鉴别古代毛织品残片毛种类的方法,其特征在于,三(羟甲基)氨基甲烷-HCl的pH为6.7-6.9。
6.如权利要求1所述的一种基于蛋白质组学鉴别古代毛织品残片毛种类的方法,其特征在于,步骤11)中,凝胶电泳具体操作为:将电压调至28-32V电泳18-22min;当样品完全进入分离胶后,再将电压调成80-100V;当样品的溴酚蓝迁移至玻璃胶板底部约0.8-1.2cm时,即可停止电泳。