1.一种奶牛肝干细胞的分离提取方法,其特征在于:包括如下步骤:(1)取奶牛肝脏用灌流液A进行灌流,流速为45~55mL/min,灌流时间为10~15min;观察到肝脏颜色呈土黄色且无颜色变化时,继续灌流2~3min;
(2)用灌流液B继续灌流,流速为45~55mL/min,灌流时间为2~3min;
(3)用灌流液C继续灌流13~17min,灌流速度为15~25mL/min;
(4)将肝脏组织终止消化后,过筛网得到组织悬液,所述终止消化采用胎牛血清进行,所述筛网目数为80~180目;
(5)将步骤(4)中的组织悬液离心,取沉淀即得肝脏非实质细胞,所述离心方法为先在
50~55g的转速下离心5~10min,再在200~220g的转速下离心5~10min;
(6)将肝脏非实质细胞重悬得细胞悬液;
(7)将上述细胞悬液加入到Percoll液上方,离心弃上清及分离液,即得肝干细胞,所述的Percoll液质量百分数为50%,所述离心的条件为4℃离心10min,转速为600g,所述Percoll液和细胞悬液的体积比大于1:1;
所述灌流液A包括以下重量份数的组分:NaCl 8~8.2份、KCl 0.4~0.6份、葡萄糖0.4~0.5份、HEPES 2~3份、EDTA 0.1~0.2份;所述灌流液B包括以下重量份数的组分:NaCl 8~8.2份、KCl 0.4~0.6份、葡萄糖0.4~0.5份、HEPES 6~7份、CaCl2 0.5~0.7份;所述灌流液C是将IV型胶原酶溶于灌流液B中得到的。
2.根据权利要求1所述的奶牛肝干细胞的分离提取方法,其特征在于:所述灌流液A、灌流液B、灌流液C均经36~38℃预热。
3.根据权利要求1所述的奶牛肝干细胞的分离提取方法,其特征在于:步骤(6)中细胞6
悬液的密度为1×10cells/mL。