1.一种检测猪病毒性繁殖障碍症候群病原核酸的MLPA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括：

（1）反转录和预扩增混合液：

该混合液包含反转录和预扩增引物，其序列如SEQ ID NO：1～12所示，分别用于反转录和预扩增；其中，反转录引物为12碱基随机引物；

（2）多重连接探针混合液：

该混合液包括探针和通用引物；其中，探针的序列如SEQ ID NO：13～24所示，通用引物的序列如SEQ ID NO：25～26所示；

（3）MLPA缓冲液；

（4）连接缓冲液A和B；其中，连接缓冲液A包括Coenzyme NAD；连接缓冲液B包括Tris‑HCl、MgCl2、non‑ionic detergent；

（5）连接酶Ligase‑65；

（6）PCR反应混合液，其包括序列SEQ ID N O：25～26所示的通用引物；

（7） SALSA聚合酶；

（8) 阴性对照；

（9) 阳性对照，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的阳性对照质粒；

所述序列SEQ ID NO：1‑2是猪繁殖与呼吸综合征病毒预扩增引物；所述序列SEQ ID NO：3‑4是猪日本乙型脑炎病毒预扩增引物；所述序列SEQ ID NO：5‑6是猪瘟病毒预扩增引物；所述序列SEQ ID NO：7‑8是猪圆环病毒2型预扩增引物；所述序列SEQ ID NO：9‑10是猪伪狂犬病毒预扩增引物；所述序列SEQ ID NO：11‑12是猪细小病毒预扩增引物；所述序列SEQ ID NO：13‑14为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的左侧探针和右侧探针；所述序列SEQ ID NO：15‑16分别为检测猪日本乙型脑炎病毒的左侧探针和右侧探针；所述序列SEQ ID NO：17‑18分别为检测猪瘟病毒的左侧探针和右侧探针；所述序列SEQ ID NO：19‑20分别为检测猪圆环病毒2型的左侧探针和右侧探针；所述序列SEQ ID NO：21‑22分别为检测猪伪狂犬病毒的左侧探针和右侧探针；所述序列SEQ ID NO：23‑24分别为检测猪细小病毒的左侧探针和右侧探针；其中，所述SEQ ID NO：14、16、18、20、22、24的5’端进行磷酸化处理；所述序列SEQ ID NO：25、26分别是通用PCR扩增的正向和反向引物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中的阳性对照来自病毒核酸RNA经反转录后，其特异基因片段与质粒连接所得的重组质粒混合物；其中特异基因分别为猪繁殖与呼吸综合征病毒的M基因、猪日本乙型脑炎病毒的E基因、猪瘟病毒的E2基因、猪圆环病毒2型的ORF2基因、猪伪狂犬病毒的gE基因和猪细小病毒的VP2基因。

3.利用权利要求1所述试剂盒实现同时检测6种猪病毒性繁殖障碍症候群病原核酸的非诊断目的MLPA检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）磁珠法提取样品DNA、RNA；

使用磁珠DNA、RNA共提取试剂盒和全自动核酸提取仪，同时提取样品中的DNA和RNA，得到200 µL样品；

（2） RNA反转录成cDNA及预扩增进行一步法反转录RT‑PCR反应；

配制25 μL反应体系：10 μL OneStep Ahead RT‑PCR Master Mix，1 μL OneStep Ahead RT‑Mix，5 μL DNA或RNA，1 μL随机反转录引物和5 μL预扩增引物混合液；终浓度为每条引物0.5 μM，3 μL H2O补足；

反应条件：50℃ 10 min，95℃ 5 min；95℃ 15 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，40个循环；72℃ 2 min；

（3） MLPA扩增和检测

a)DNA变性

取0.2 mL PCR反应管，每管加入0.5 μL DNA溶液和4.5 μL TE，98℃变性5 min，降至室温25℃；

b)探针与样本DNA的杂交

配制3 μL混匀的探针混合液：1.5 μL MLPA缓冲液 + 1.5 μL探针混合液；

将探针混合物加入上述PCR反应管中，95℃温育1 min，60℃杂交1‑16 h，54℃温育；

c)杂交探针的连接

配制32 μL连接酶混合物：25 μL dH2O + 3 μL 连接缓冲液A + 3 μL 连接缓冲液B + 1 μL连接酶Ligase‑65；

PCR仪温度降至54℃，打开管盖，加入32 μL连接酶混合物，54℃温育15 min，98℃加热5 min灭活连接酶，20℃温育；

d)连接探针的PCR扩增

配制10 μL PCR混合液：7.5 μL dH2O + 2 μL PCR反应混合液 + 0.5 μL SALSA聚合酶；

取出PCR管，室温下加入10 μL PCR混合物；开始PCR反应，反应条件为：95℃ 30 s，60℃ 

30 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃孵育20 min，降至15℃；

e)全自动核酸分析仪分析：

PCR扩增产物取20μL，用全自动核酸分析仪进行分析；

（4）结果描述及判定

a） 质控标准：

阳性对照在94 bp、100 bp、106 bp、116 bp、122 bp、127 bp处有特异性扩增条带；

阴性对照无特异性扩增条带；

如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效；

b） 结果判断：

阳性：在94 bp有特异性扩增条带，表示样本中存在猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸、在100 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪日本乙型脑炎病毒的核酸；在106bp 处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪瘟病毒的核酸；在116 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪圆环病毒2型的核酸；在122 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪伪狂犬病毒的核酸；在127 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪细小病毒的核酸；同时对MLPA扩增产物进行测序，进一步确认；

阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒。