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专利号: 2018111375396
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种表达D-甘露糖异构酶(D-MI)的重组大肠杆菌,其特征在于,是将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的D-甘露糖异构酶基因(mi)转入大肠杆菌(Escherichia coli)得到的基因工程菌。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,编码D-甘露糖异构酶的基因(mi)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌,其特征在于,以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主。

4.根据权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌,其特征在于,以pET-24a为表达载体。

5.一种构建权利要求1-4任一所述重组大肠杆菌的方法,其特征在于,所述方法包括:

1)以恶臭假单胞菌的基因组为模板,设计引物,经PCR扩增得到目的基因D-甘露糖异构酶基因(mi);

2)将目的基因连接到表达载体pET-24a,得到重组质粒pET-24a-mi;

3)将重组质粒pET-24a-mi通过转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3),获得大肠杆菌D-MI基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤1)中得到的D-甘露糖异构酶基因(mi)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌在D-甘露糖生产中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述应用包括以下步骤:(1)重组大肠杆菌发酵产D-甘露糖异构酶;

(2)D-甘露糖异构酶催化D-果糖生成D-甘露糖。

9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,步骤(1)包括将重组大肠杆菌菌株接种于LB培养基中,在36-38℃下培养8-10h后,以4-6%接种量转接至TB发酵培养基中,先放至36-

38℃、190-210rpm恒温培养1-2h,当菌体OD600达到0.5-1.0时加入诱导剂IPTG12.5-25μL,此后转至24-26℃、190-210rpm进行诱导发酵22-26h,发酵结束后,收集菌体、破碎、离心后,所得上清即为重组大肠杆菌所产的D-甘露糖异构酶酶液。

10.根据权利要求8或9所述的应用,其特征在于,步骤(2)包括在初始反应温度50-55℃,起始pH 7.5-8.0,D-果糖为200-250g/L的情况下,加步骤(1)制备得到的D-甘露糖异构酶酶液,加酶量控制为0.04-0.06mL/mL;设置水浴摇床温度为50-55℃、转速160-170r/min,煮沸终止反应。