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专利号: 2018112667565
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-08-19
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种异源重组毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF,其特征在于,所述异源重组毕赤酵母工程菌携带来源于短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CotA漆酶优良突变体GWLF的目的基因;将优化的GWLF漆酶基因重组进毕赤酵母GS115基因组得到的所述工程菌。

2.根据权利要求1所述的异源重组毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF,其特征在于,所述优化的GWLF漆酶基因的核酸序列如SEQ.ID.No.1所示。

3.根据权利要求1所述的异源重组毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF,其特征在于,所述优化的GWLF漆酶基因的氨基酸序列如SEQ.ID.No.2所示。

4.一种含有权利要求1所述目的基因的质粒或细胞。

5.一种权利要求1所述异源重组毕赤酵母工程菌的应用,其特征在于,将其用于制备GWLF漆酶。

6.根据权利要求5的应用,其特征在于,所述制备GWLF漆酶的方法包括如下步骤:

(1)将优化的GWLF漆酶基因连入毕赤酵母表达载体pPIC9K,得到重组表达载体pPIC9K-LacGWLF;

(2)将重组表达载体pPIC9K-LacGWLF经Sac I单酶切线性化之并纯化后电转化至GS115菌株,得到异源重组酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF,并在含100μg/L zeocin的YPD平板进行阳性转化子筛选;以YPD平板上的转化子为模板,以5′AOX 1和3′AOX 1为引物进行PCR鉴定。PCR鉴定正确的转化子接种到含有0.3mM ABTS和0.25mM CuSO4的BMMY平板上进行活性鉴定,菌落周围出现蓝绿色反应圈的转化子为重组毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF;

(3)挑取重组毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基,30℃,200rpm培养至OD600=2-6,于

8000×g,4℃离心5min收集细胞,然后收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近于

1.0,于30℃,200rpm震荡培养,每天补加终浓度为0.5%的甲醇;发酵四天后在8000×g,4℃离心5min回收发酵液上清液;用亲和层析的方法对上清液进行纯化,SDS-PAGE分析可得明显特异条带;收集重组GWLF,所述BMMY培养基中含有0.25mM CuSO4。

7.一种重组GWLF的应用,其特征在于,将其用于偶氮染料的脱色降毒。