1.一种基于Western Bolt测定古遗址中蚕丝蛋白微痕迹的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)取2.5-3.5mg古遗址中蚕丝蛋白微痕迹,用乙醇水溶液对其常温浸泡25-35min,然后离心处理,移去上清液,下层物质于通风处晾干;
2)向晾干后的样品中加入100-200μL的RIPA裂解液,震荡混匀,在60-70℃下裂解10-
20min,期间震荡3-5次;
3)充分裂解后,向溶液中加入4-6wt%的NaCl溶液100-150μL,于-25℃至-15℃下静置
8-12min析出蚕丝蛋白,离心处理;
4)移上清液到另一离心管中,重复步骤3)至少两次,然后用乙醇水溶液分别洗涤多次离心后所得的蛋白沉淀,震荡均匀后将多个离心管内样品合为一管,离心处理,移去上清液,通风晾干;
5)向步骤4)所得蛋白沉淀中加入1-2μL的DNA酶,1-2μL的RNA酶以及35-45μL体积比为1∶7-9∶1-3的CaCl2∶H2O∶ethanol溶液,于60-70℃孵育8-12min,获得蚕丝蛋白微痕迹溶液;
6)按重量比1∶1-2向蚕丝蛋白微痕迹溶液中加入叠氮化合物缓冲液,在1-5℃下轻微震荡过夜,得到叠氮化合物标记的蚕丝蛋白;
7)在1mL的PBS缓冲液中加入1mg的NHS-三芳基膦,0.5mL的N,N-二甲基甲酰胺和20mg的HRP标记的羊抗兔抗体,将所得混合物室温震荡1-3h,然后过30kDa截留分子量的柱纯化,获得三芳基膦标记与HRP标记的羊抗兔抗体;
8)采用TGX快速免染制胶试剂盒制备SDS-PAGE凝胶;对抗桑蚕丝素蛋白抗体进行跑电泳测试,使用4-6μL未染marker作为蛋白分子量标准物,在浓缩胶中控制电压80v,在分离胶中控制电压120v,待溴酚蓝前沿到达凝胶底部停止电泳,在化学发光成像仪中可观察电泳结果;紧接着将电泳分离之后的抗体在300mA、冰水浴条件下50-70min转印到聚偏氟乙烯膜上,在化学发光成像仪中可观察转印结果;在室温摇床上使用20-30mL的0.4-0.6wt%的脱脂奶粉溶液封闭聚偏氟乙烯膜上的非特异性结合点,封闭时间控制在1-2h;待封闭结束后,使用步骤5)所获得的蚕丝蛋白微痕迹溶液点到聚偏氟乙烯膜上并室温孵育1-2h,使用标准的蚕丝蛋白溶液作为阳性对照,缓冲液作为阴性对照;孵育结束后,使用缓冲液洗涤2-4次,每次4-6min,紧接着加入20-30mL的三芳基膦标记与HRP标记的羊抗兔抗体,保持在室温摇床上孵育1-2h,然后再次使用缓冲液洗涤2-4次,避光向聚偏氟乙烯膜上加入0.8-1.2mL显色液,反应4-6min后移至化学发光成像仪中观察免疫结果;
若检测到条带则证实所提取的样品由桑蚕丝制作而成,若没有检测到条带则说明所提取的样品不是由桑蚕丝制作而成。
2.如权利要求1所述的一种基于Western Bolt测定古遗址中蚕丝蛋白微痕迹的方法,其特征在于,步骤1)中,所述乙醇水溶液浓度为70-80wt%,离心速率为500-1000r/min,离心时间为1-3min。
3.如权利要求1所述的一种基于Western Bolt测定古遗址中蚕丝蛋白微痕迹的方法,其特征在于,步骤3)中,离心速率为10000-15000r/min,离心时间3-5min。
4.如权利要求1所述的一种基于Western Bolt测定古遗址中蚕丝蛋白微痕迹的方法,其特征在于,步骤4)中,所述乙醇水溶液浓度为70-80wt%,离心速率为10000-15000r/min,离心时间3-5min。
5.如权利要求1所述的一种基于Western Bolt测定古遗址中蚕丝蛋白微痕迹的方法,其特征在于,步骤6)中,所述叠氮化合物缓冲液包括:20mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸,50mM的氯化钠,9mM的氯化锰和质量分数为1.5-2.5%的乙基苯基聚乙二醇。
6.如权利要求1所述的一种基于Western Bolt测定古遗址中蚕丝蛋白微痕迹的方法,其特征在于,步骤8)中,所述缓冲液由50mL的1M,pH=7.5的Tris·HCl,8g Nacl,0.2g KCl和0.5mL吐温混合后加蒸馏水定容至1L配制而成。
7.如权利要求1所述的一种基于Western Bolt测定古遗址中蚕丝蛋白微痕迹的方法,其特征在于,步骤8)中,采用TGX快速免染制胶试剂盒制备SDS-PAGE凝胶,首先将分离胶A液、分离胶B液、10%APS、四甲基乙二胺按照1∶1∶0.01∶0.001的重量比混合,注入搭好的两玻璃板之间,加入1mL异丙醇,置于37℃干燥箱中10min待分离胶凝固,倒掉异丙醇;然后将浓缩胶A液、浓缩胶B液、10%APS、四甲基乙二胺按重量比1∶1∶0.01∶0.002混合,注入两块玻璃板之间至液体溢出,最后将梳子插入两块玻璃板之间放于37℃干燥箱中10min备用。