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专利号: 2018115166987
申请人: 沈阳农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法,其特征在于:包括提取驴的DNA并检测、确定驴的13对微卫星位点并合成微卫星引物、PCR扩增得到13条目标微卫星序列及检测结果分析步骤;所述驴的13对微卫星点位及产物大小范围分别为:AHT4:126-

162bp,HMS7:212-220bp,HTG7:279-299bp,ASB23:361-379bp,HMS3:444-456bp,HTG10:111-

133bp,TKY312:200-208bp,HMS2:308-328bp,TKY297:405-429bp,HMS6:481-497bp,HMS18:

174-192bp,TKY343:256-262bp,TKY337:375-387bp;

所述13对微卫星引物的退火温度相差小于等于2℃;将所述13对微卫星引物合成13对荧光引物。

2.根据权利要求1所述用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法,其特征在于:所述PCR扩增得到13条目标微卫星序列产物,按照如下步骤进行:驴的微卫星13重PCR扩增:使用上述合成13对荧光引物,按照各自确定的引物终浓度配成引物混合液加入反应体系,反应体系为15ul:引物混合液6ul、DNA聚合酶(2xEasyTaq PCR SuperMix,全式金生物)7.5ul、待测驴的DNA 1~50ng,加灭菌水补齐至15ul;PCR扩增程序为:95℃预变性5分钟;95℃变性30秒,退火温度58.5℃30秒,72℃延伸1分钟,共30个循环;

72℃延伸20分钟;4℃保持;通过一次PCR扩增得到13条目标微卫星序列产物。

3.根据权利要求1所述用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法,其特征在于,所述13对微卫星引物序列为:微卫星点位AHT4,引物序列F:AACCGCCTGAGCAAGGAAGT,R:GCTCCCAGAGAGTTTACCCT;产物范围126-162bp,引物终浓度63.3nM/L,携带标记为FAM;

微卫星点位HMS7,引物序列F:GCAGTCCTGTGTACCCTTCA,R:GGTAGATACATGAACCCAGACG;产物范围212-220bp,引物终浓度63.3nM/L,携带标记为FAM;

微卫星点位HTG7,引物序列F:GGATGTGAACCCAACTTTATGAG,R:GCAGAGCTGCTACACGGACT;

产物范围279-299bp,引物终浓度110nM/L,携带标记为FAM;

微卫星点位ASB23,引物序列F:GCCTTTATCTCCCCTTTTCAAC,R:GAAAGTCTTGGTTTTGGCATTG;产物范围361-379bp,引物终浓度146.7nM/L,携带标记为FAM;

微卫星点位HMS3,引物序列F:TCAGATAGTGATAATGCCGTGG,R:GCTCTAAAGCCCCAACTCTTTG;

产物范围444-456bp,引物终浓度96.7nM/L,携带标记为FAM;

微卫星点位HTG10,引物序列F:TGGGCTTTTTATTCTGATCTGTC,R:AGTTTATTACAAATGGCCAATTCC;产物范围111-133bp,引物终浓度300nM/L,携带标记为HEX;

微卫星点位TKY312,引物序列F:TGTCTGCACTCTTAAGCTCAT,R:TAATGCTTTCCAGGTTCATC;

产物范围200-208bp,引物终浓度233.3nM/L,携带标记为HEX;

微卫星点位HMS2,引物序列F:GATCTCTAGCTCAGTAAATCACAGG,R:ACGGTGGCAACTGCCAAGGAAG;产物范围308-328bp,引物终浓度80nM/L,携带标记为HEX;

微卫星点位TKY297,引物序列F:CCTGGCTCTAGGAGATTCCA,R:AGGCTTGGTGTATTCAACCTACTC;产物范围405-429bp,引物终浓度76.7nM/L,携带标记为HEX;

微卫星点位HMS6,引物序列F:AGGTGAGACGCACTTCTGTTATCAG,R:GTCATTCCCTGCATTTCATCACTAA;产物范围481-497bp,引物终浓度93.3nM/L,携带标记为HEX;

微卫星点位HMS18,引物序列F:CAACAATGAAAATTTGTCCTGTGC,R:GTAAATGAGTAGACAATCATGAGG;产物范围174-192bp,引物终浓度130nM/L,携带标记为TAMARA;

微卫星点位TKY343,引物序列F:GCCTCTCCAGATAGTCCCTA,R:CCAAAGGTCACCAGATAATTG;

产物范围256-262bp,引物终浓度366.7nM/L,携带标记为TAMARA;

微卫星点位TKY337,引物序列F:GCTAATGCAGCACAGCTTGT,R:ATGAATAAGGGATGTGACATTAGTC;产物范围375-387bp,引物终浓度240nM/L,携带标记为TAMARA。

4.根据权利要求1或2所述用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法,其特征在于,每对引物中至少一条使用荧光标记标记其5’端,13对引物分为3组,每组使用不同荧光标记,其中:AHT4、HMS7、HTG7、ASB23、HMS3为第一组,使用FAM荧光标记;HTG10、KTY312、TKY337、HMS2、TKY297、HMS6为第二组,使用HEX荧光标记;HMS18、TKY337、TKY343为第三组,使用TAMRA荧光标记。

5.根据权利要求1所述用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法,其特征在于:所述检测结果分析步骤,按照如下方法进行:使用ABI 3730xl测序仪和Genemapper v4.0软件检测上述PCR产物,获得待测样品在13个微卫星位点上的基因分型;对比两个样本的13个微卫星位点的基因型,如果完全一致,判断为同一个体,反之不是同一个体;对比待测样本与亲本的13个微卫星位点的基因分型,根据等位基因的遗传定律判断二者的亲子关系。

6.根据权利要求1所述用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法,其特征在于:所述提取驴的DNA:是采集驴的毛发、血液、皮肤、肌肉或器官组织。

7.如权利要求1-4任一所述的检测方法用于驴的个体识别、亲子鉴定或性别鉴定的应用。