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专利号: 2018115656609
申请人: 湖北工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD),其特征在于:所述肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)的编码氨基酸序列是:MNDYRNKIEAGYAPVYQNNKGTDLYQWENVPKAVVEGLEGTLNVPVSETVNWTNNITYMLQSKNKETGDRLSIIPEYTLNSTLSWQVRDDVSLQSTFGGSGGSGGSGGSDRLVVLHDHYLDRVTDVAQRFPQRARKDGRFYAIDFTLDEIKSLKFTEGFEPKNGKNVQTYPGRFPMGKSDFRIHTFEEEIEGGSGGSGGSGGSLDSPVDISQLADMAGMPVSKLKTFNAGVKGSTLGASGPKYVMVPQKHAAQLRESLASGDIAAVQPTQLADNTPLTSRSYKVRSGDTISGIASRLGVTTRD;

用于编码所述肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)的基因全序列是:

2.一种用于制备如权利要求1所述的肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)的方法,其特征在于:所述方法包括:分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA、表面蛋白GlpQ及表面蛋白mltD的胞外结构域中抗原表位及免疫原性最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列,优化该肽段基因编码序列,并将此三段基因序列用两段柔性连接肽的编码序列进行连接,形成融合基因;

所述肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA、表面蛋白GlpQ及表面蛋白mltD在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_012068422、WP_004214637及WP_004210407;

所述柔性连接肽的氨基酸序列是ggsggsggsggs;

同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为Fepglpmlt;

所述Fepglpmlt的基因全序列是:

所述Fepglpmlt的编码氨基酸序列是:

MNDYRNKIEAGYAPVYQNNKGTDLYQWENVPKAVVEGLEGTLNVPVSETVNWTNNITYMLQSKNKETGDRLSIIPEYTLNSTLSWQVRDDVSLQSTFGGSGGSGGSGGSDRLVVLHDHYLDRVTDVAQRFPQRARKDGRFYAIDFTLDEIKSLKFTEGFEPKNGKNVQTYPGRFPMGKSDFRIHTFEEEIEGGSGGSGGSGGSLDSPVDISQLADMAGMPVSKLKTFNAGVKGSTLGASGPKYVMVPQKHAAQLRESLASGDIAAVQPTQLADNTPLTSRSYKVRSGDTISGIASRLGVTTRD;

所述Fepglpmlt基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA的550-645aa、表面蛋白GlpQ的69-150aa及表面蛋白mltD的268-367aa;三段蛋白序列以两段柔性连接肽进行连接;将此基因片段按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+),用IPTG诱导重组大肠杆菌表达,用Ni2+亲和层析法纯化重组His-Fepglpmlt融合蛋白,冻干后保存备用;所述柔性连接肽的氨基酸序列是ggsggsggsggs。

3.一种肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸,其特征在于:所述肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸包括包被有肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)硝酸纤维素膜以及鼠抗人IgG单克隆抗体的乳胶微球标记物。

4.一种用于制备如权利要求3所述的肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:

1)制备肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD);

2)制备鼠抗人IgG单克隆抗体的乳胶微球标记物:

2.1)乳胶微球的活化

取浓度为10%的彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球溶液1mL,加入9mL MES缓冲液后混匀,加入NHS以及EDC,至二者的终浓度均为1mg/mL,在室温下缓慢混匀30分钟,孵育结束后

19000g离心20分钟,去上清,沉淀用10mL硼砂缓冲液(0.1mol/L Na2B4O7,pH8.5)重悬,振荡,超声处理后即成活化后的乳胶微球;所述MES缓冲液中组分及含量是:0.1mol/L MES,所述MES缓冲液的pH=8.5;所述彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的粒径是100nm;所述硼砂缓冲液的组分及含量是:0.1mol/L Na2B4O7,所述硼砂缓冲液的pH=8.5;

2.2)乳胶微球标记物的制备

用硼砂缓冲液将鼠抗人IgG单克隆抗体配制成1mg/mL;取10mL鼠抗人IgG单克隆抗体加入10mL活化乳胶微球,缓慢混匀30分钟后19000g离心10分钟,去上清;沉淀用10mL含有1%酪蛋白的硼砂缓冲液重悬,经超声粉碎后重复离心1次,去上清;沉淀同法重悬,经超声粉碎后重复离心1次,去上清;沉淀用10mL含有1%酪蛋白的硼砂缓冲液重悬,即为鼠抗人IgG单克隆抗体的乳胶微球标记物;所述硼砂缓冲液的组分及含量是:0.1mol/L Na2B4O7,所述硼砂缓冲液的pH=8.5;

3)结合垫的制备:

向聚酯纤维材质的结合垫上喷涂鼠抗人IgG单克隆抗体的乳胶微球标记物,每平方厘米聚酯纤维膜的喷涂量为20μL乳胶微球标记物;喷涂完后在相对湿度不超过30%的环境中在37℃下烘干,剪裁成所需的规格,25℃密封干燥保存;

4)抗原固相硝酸纤维素膜的制备:

用硼砂缓冲液将步骤1)所得的肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)稀释成2mg/mL后用喷膜仪包被到硝酸纤维素膜上的检测线位置作为检测线捕获抗原,包被参数为1μL/cm;将羊抗鼠IgG多克隆抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的质控线位置作为控制线捕获抗体,浓度为1mg/mL,包被参数为1μL/cm;其中,所述的检测线与所述的质控线的距离为0.7cm,所述检测线与所述质控线与硝酸纤维素膜的边距分别均为0.8cm;包被完后将该硝酸纤维素膜放在相对湿度不超过30%的环境中,于37℃下烘干,剪裁成所需的规格,25℃密封干燥保存;所述硼砂缓冲液的组分及含量是0.1mol/L Na2B4O7,所述硼砂缓冲液的pH=8.5;

5)样品垫的制备

取玻璃纤维素膜一张,将其在样品垫处理液中浸泡至少3h以上,再置于生物安全柜内

37℃通风干燥后,剪裁成所需的规格,25℃密封干燥保存;至此制得样品垫;所述样品垫处理液中各组分及含量是:0.01mol/L Na2B4O7,2g/L氯化钠,20g/L酪蛋白,10ml/L吐温-20,

10ml/L消泡剂S-17;所述样品垫处理液的pH=8.5;

6)试纸条的组装

分别将吸水滤纸材质的吸水垫、抗原固相硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、依次粘贴在PVC底板上,硝酸纤维素膜上所述的质控线靠近吸水垫端,所述的检测线靠近样品垫端,再切割成一定宽度的试纸条,密封包装,干燥低温保存;至此制得肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸条。