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专利号: 2018115659927
申请人: 湖北工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种卡他莫拉菌表面蛋白M35+OlpA,其特征在于:所述卡他莫拉菌表面蛋白M35+OlpA的蛋白质序列是:

MEDTNESGLNSNTSRIGFKGSEALNANTDVVYQLEYKIDIDADRGDNFKSRDTYLGLAHKQYGTLLAGRLTTIDDSVDFASMLEDNNVADIGPTFNAPRANNAFAYVSPEYNGTQFLAMYAFDSDTDKGGLAKDDQFGVGATYSTGPINAGATYIHYGDDSHIRLGGSGGSGGSGGSGYYVQADLGYSNLEAKYNDNRPNDNKLEDKGLGYGISFGKDTDLARYALDYKNYGKINSSYTYQPQTNTSITSSGELKAQSLGLSAIYDFDTVSGFTPYAGARVDINQIKSTVSTVTTTAAAQ;

用于编码卡他莫拉菌表面蛋白M35+OlpA的蛋白质的基因全序列是:CATATGGAGGATACTAACGAGTCTGGTCTGAACAGCAACACCTCTCGTATCGGCTTTAAGGGTAGCGAAGCTCTGAACGCAAACACCGACGTAGTTTACCAGCTGGAGTACAAAATCGACATCGATGCTGACCGTGGTGACAACTTCAAATCTCGTGATACTTACCTGGGCCTGGCACATAAACAGTACGGTACTCTGCTGGCTGGCCGCCTGACCACTATCGATGATTCTGTGGATTTCGCATCTATGCTGGAAGACAACAACGTTGCAGACATCGGCCCGACCTTCAACGCTCCGCGTGCAAACAACGCATTTGCTTACGTGTCTCCGGAATACAACGGTACCCAGTTTCTGGCCATGTATGCTTTCGATTCCGATACCGACAAAGGTGGCCTGGCGAAAGATGACCAGTTCGGTGTTGGCGCTACTTACTCTACCGGTCCAATCAACGCTGGCGCAACTTACATCCACTACGGCGATGACAGCCACATTCGCCTGGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTTACTACGTACAGGCGGACCTGGGCTACTCCAACCTGGAAGCCAAATACAACGACAACCGCCCGAACGACAACAAGCTCGAAGACAAAGGTCTGGGCTACGGTATCTCTTTCGGCAAAGATACTGACCTGGCTCGCTACGCGCTGGACTACAAAAACTACGGTAAGATCAACTCCTCTTACACCTACCAGCCGCAGACTAACACCTCTATCACCTCTTCTGGCGAACTGAAAGCACAGTCCCTGGGTCTGAGCGCGATCTACGATTTCGACACCGTATCCGGTTTCACCCCGTACGCAGGCGCTCGTGTTGACATCAACCAGATCAAATCTACCGTTTCCACCGTAACTACCACCGCAGCTGCACAGTAAGGATCC。

2.用于制备如权利要求1所述的卡他莫拉菌表面蛋白M35+OlpA的方法,其特征在于:所述方法是:

分别获取卡他莫拉菌表面蛋白M35及表面蛋白OlpA胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列,优化肽段基因编码序列,并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接,形成融合基因;所述卡他莫拉菌表面蛋白M35及表面蛋白OlpA在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为AY905613及DQ996463;所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs;同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为M35olp;

所述M35olp的基因全序列是:

CATATGGAGGATACTAACGAGTCTGGTCTGAACAGCAACACCTCTCGTATCGGCTTTAAGGGTAGCGAAGCTCTGAACGCAAACACCGACGTAGTTTACCAGCTGGAGTACAAAATCGACATCGATGCTGACCGTGGTGACAACTTCAAATCTCGTGATACTTACCTGGGCCTGGCACATAAACAGTACGGTACTCTGCTGGCTGGCCGCCTGACCACTATCGATGATTCTGTGGATTTCGCATCTATGCTGGAAGACAACAACGTTGCAGACATCGGCCCGACCTTCAACGCTCCGCGTGCAAACAACGCATTTGCTTACGTGTCTCCGGAATACAACGGTACCCAGTTTCTGGCCATGTATGCTTTCGATTCCGATACCGACAAAGGTGGCCTGGCGAAAGATGACCAGTTCGGTGTTGGCGCTACTTACTCTACCGGTCCAATCAACGCTGGCGCAACTTACATCCACTACGGCGATGACAGCCACATTCGCCTGGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTTACTACGTACAGGCGGACCTGGGCTACTCCAACCTGGAAGCCAAATACAACGACAACCGCCCGAACGACAACAAGCTCGAAGACAAAGGTCTGGGCTACGGTATCTCTTTCGGCAAAGATACTGACCTGGCTCGCTACGCGCTGGACTACAAAAACTACGGTAAGATCAACTCCTCTTACACCTACCAGCCGCAGACTAACACCTCTATCACCTCTTCTGGCGAACTGAAAGCACAGTCCCTGGGTCTGAGCGCGATCTACGATTTCGACACCGTATCCGGTTTCACCCCGTACGCAGGCGCTCGTGTTGACATCAACCAGATCAAATCTACCGTTTCCACCGTAACTACCACCGCAGCTGCACAGTAAGGATCC;

所述M35olp基因编码的蛋白质序列是:

MEDTNESGLNSNTSRIGFKGSEALNANTDVVYQLEYKIDIDADRGDNFKSRDTYLGLAHKQYGTLLAGRLTTIDDSVDFASMLEDNNVADIGPTFNAPRANNAFAYVSPEYNGTQFLAMYAFDSDTDKGGLAKDDQFGVGATYSTGPINAGATYIHYGDDSHIRLGGSGGSGGSGGSGYYVQADLGYSNLEAKYNDNRPNDNKLEDKGLGYGISFGKDTDLARYALDYKNYGKINSSYTYQPQTNTSITSSGELKAQSLGLSAIYDFDTVSGFTPYAGARVDINQIKSTVSTVTTTAAAQ;

所述M35olp基因编码的蛋白质序列为卡他莫拉菌表面蛋白M35的50‑213aa及表面蛋白OlpA的26‑148aa;两段蛋白序列中间以柔性连接肽ggsggsggsggs进行连接;

将M35olp的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET‑28a(+),转入E.coli 

2+

BL21(DE3)菌中,用IPTG诱导重组大肠杆菌表达,用Ni 亲和层析法纯化重组M35olp蛋白。

3.一种用于制备抗卡他莫拉菌表面蛋白M35+OlpA多克隆抗体的方法,其特征在于:所述方法是将如权利要求2所述的重组M35olp蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔,抽血进行效价测定,分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化,最终获得抗卡他莫拉菌表面蛋白M35+OlpA多克隆抗体。

4.一种卡他莫拉菌表面蛋白McaP+OmpCD,其特征在于:所述卡他莫拉菌表面蛋白McaP+OmpCD的蛋白质序列是:

MQDYHLSDSITADVKQTGIGLYHRHDFDHLRISANLGVDHLSTQSLRQIMWDGENRNHQAHATGQRRYASVQGSYGFTQNNVTYRPYVGIHAQDIKQNRFFENQPNLSTALSFKLPDHQSLQADIGVNIDYAMNDKLNLLAGLGYQHEFKDNNKTVETAVLSNRDYHRSFVTTVPFDKKHTTHAHLGATLALGNNTHLEAAAAKEAAAAKKILRTGKKLELDATNAPAPANGGVALDSELWTGAAIGIELTPSTQFQVEYGISNRDAKSSDKSAHRFDAEQETISGNFLIGTEQFSGYNPTNKFKPYVLVGAGQSKIKVNAIDGYTAEVANGQNIAKDQAVKAGQEVAESKDTIGN;

用于编码所述卡他莫拉菌表面蛋白McaP+OmpCD的蛋白质的基因全序列是:CATATGCAGGACTATCACCTCAGCGACTCCATTACCGCTGACGTTAAGCAGACTGGCATCGGTCTTTATCATCGCCACGACTTCGACCACCTGCGTATTTCTGCAAACCTGGGCGTAGATCACCTGTCTACTCAGAGTCTGCGTCAAATCATGTGGGACGGTGAAAACCGCAACCACCAGGCACATGCTACCGGCCAGCGTCGTTATGCATCCGTACAGGGTTCCTACGGTTTCACTCAGAACAACGTTACCTACCGCCCATACGTAGGCATCCACGCACAGGACATCAAACAGAACCGCTTCTTCGAAAACCAGCCGAACCTCAGCACTGCTCTGTCCTTCAAGCTGCCGGACCACCAGAGCCTGCAGGCTGATATCGGCGTTAACATCGATTACGCAATGAACGACAAACTGAACCTGCTGGCTGGTCTGGGCTATCAGCATGAATTCAAAGACAACAACAAAACTGTGGAAACCGCGGTTCTGTCTAACCGTGATTACCATCGCTCCTTCGTTACTACCGTACCGTTCGACAAAAAACACACCACCCACGCTCACCTCGGTGCTACTTTAGCGCTGGGCAACAACACCCACCTGGAAGCTGCTGCTGCTAAAGAAGCTGCTGCTGCTAAAAAAATCCTGCGTACTGGTAAGAAACTGGAACTGGACGCTACCAACGCGCCGGCTCCTGCAAACGGTGGCGTTGCGCTCGACTCCGAACTGTGGACCGGCGCTGCCATCGGTATCGAACTGACTCCGTCTACTCAGTTCCAGGTTGAATACGGTATCTCCAACCGCGACGCTAAATCTTCCGACAAATCTGCCCACCGCTTCGATGCAGAACAGGAAACCATCTCTGGCAACTTCCTGATCGGTACTGAACAGTTCTCCGGCTACAACCCAACCAACAAATTCAAACCTTACGTACTGGTTGGCGCTGGTCAGTCTAAAATTAAGGTGAACGCAATCGACGGCTACACTGCAGAAGTTGCGAACGGTCAGAACATTGCGAAAGACCAGGCAGTGAAAGCAGGCCAGGAAGTTGCGGAATCCAAAGACACCATCGGTAACTAAGGATCC。

5.用于制备如权利要求4所述的卡他莫拉菌表面蛋白McaP+OmpCD的方法,其特征在于:所述方法是:

分别获取卡他莫拉菌表面蛋白McaP及表面蛋白OmpCD胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列,优化肽段基因编码序列,并将优化后的肽段基因编码序列用刚性连接肽的编码序列进行连接,形成融合基因;所述卡他莫拉菌表面蛋白McaP及表面蛋白OmpCD在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为EF075940及AAA66180;

所述刚性连接肽的序列是eaaakeaaak;同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为Mcapomp;

所述Mcapomp的基因全序列是:

CATATGCAGGACTATCACCTCAGCGACTCCATTACCGCTGACGTTAAGCAGACTGGCATCGGTCTTTATCATCGCCACGACTTCGACCACCTGCGTATTTCTGCAAACCTGGGCGTAGATCACCTGTCTACTCAGAGTCTGCGTCAAATCATGTGGGACGGTGAAAACCGCAACCACCAGGCACATGCTACCGGCCAGCGTCGTTATGCATCCGTACAGGGTTCCTACGGTTTCACTCAGAACAACGTTACCTACCGCCCATACGTAGGCATCCACGCACAGGACATCAAACAGAACCGCTTCTTCGAAAACCAGCCGAACCTCAGCACTGCTCTGTCCTTCAAGCTGCCGGACCACCAGAGCCTGCAGGCTGATATCGGCGTTAACATCGATTACGCAATGAACGACAAACTGAACCTGCTGGCTGGTCTGGGCTATCAGCATGAATTCAAAGACAACAACAAAACTGTGGAAACCGCGGTTCTGTCTAACCGTGATTACCATCGCTCCTTCGTTACTACCGTACCGTTCGACAAAAAACACACCACCCACGCTCACCTCGGTGCTACTTTAGCGCTGGGCAACAACACCCACCTGGAAGCTGCTGCTGCTAAAGAAGCTGCTGCTGCTAAAAAAATCCTGCGTACTGGTAAGAAACTGGAACTGGACGCTACCAACGCGCCGGCTCCTGCAAACGGTGGCGTTGCGCTCGACTCCGAACTGTGGACCGGCGCTGCCATCGGTATCGAACTGACTCCGTCTACTCAGTTCCAGGTTGAATACGGTATCTCCAACCGCGACGCTAAATCTTCCGACAAATCTGCCCACCGCTTCGATGCAGAACAGGAAACCATCTCTGGCAACTTCCTGATCGGTACTGAACAGTTCTCCGGCTACAACCCAACCAACAAATTCAAACCTTACGTACTGGTTGGCGCTGGTCAGTCTAAAATTAAGGTGAACGCAATCGACGGCTACACTGCAGAAGTTGCGAACGGTCAGAACATTGCGAAAGACCAGGCAGTGAAAGCAGGCCAGGAAGTTGCGGAATCCAAAGACACCATCGGTAACTAAGGATCC;

所述Mcapomp基因编码的蛋白质序列是:

MQDYHLSDSITADVKQTGIGLYHRHDFDHLRISANLGVDHLSTQSLRQIMWDGENRNHQAHATGQRRYASVQGSYGFTQNNVTYRPYVGIHAQDIKQNRFFENQPNLSTALSFKLPDHQSLQADIGVNIDYAMNDKLNLLAGLGYQHEFKDNNKTVETAVLSNRDYHRSFVTTVPFDKKHTTHAHLGATLALGNNTHLEAAAAKEAAAAKKILRTGKKLELDATNAPAPANGGVALDSELWTGAAIGIELTPSTQFQVEYGISNRDAKSSDKSAHRFDAEQETISGNFLIGTEQFSGYNPTNKFKPYVLVGAGQSKIKVNAIDGYTAEVANGQNIAKDQAVKAGQEVAESKDTIGN;

所述Mcapomp基因编码的蛋白质序列为卡他莫拉菌表面蛋白McaP的429‑625aa及表面蛋白OmpCD的49‑194aa;两段蛋白序列中间以刚性连接肽eaaakeaaak进行连接;

将Mcapomp的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET‑28a(+),转入E.coli 

2+

BL21(DE3)菌中,用IPTG诱导重组大肠杆菌表达,用Ni 亲和层析法纯化重组Mcapomp蛋白。

6.一种用于制备抗卡他莫拉菌表面蛋白McaP+OmpCD多克隆抗体的方法,其特征在于:所述方法是将如权利要求5所述的重组Mcapomp蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔,抽血进行效价测定,分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化,最终获得抗卡他莫拉菌McaP及OmpCD蛋白多克隆抗体,用封闭液稀释至终浓度为20μg/mL;

所述封闭液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠8.5g/L,牛血清白蛋白10g/L,所述封闭液的pH是7.4。

7.一种基于卡他莫拉菌表面蛋白抗体的卡他莫拉菌Elisa检测试剂盒,其特征在于:所述基于卡他莫拉菌表面蛋白抗体的卡他莫拉菌Elisa检测试剂盒包括包被根据权利要求3制备得到的抗卡他莫拉菌表面蛋白M35+OlpA的多克隆抗体的酶标板、根据权利要求6制备得到的抗卡他莫拉菌表面蛋白McaP+OmpCD多克隆抗体、卡他莫拉菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液;所述卡他莫拉菌阳性对照是灭活的卡他莫拉菌菌液;所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液;所述洗涤液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠8.5g/L,Tween‑20 0.5mL/L,所述洗涤液的pH=7.4;所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG;所述酶显色底物是TMB显色液;所述终止液是1M HCL溶液。

8.一种基于权利要求7所述的卡他莫拉菌表面蛋白抗体的卡他莫拉菌Elisa检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述基于卡他莫拉菌表面蛋白抗体的卡他莫拉菌Elisa检测试剂盒包括包被抗卡他莫拉菌表面蛋白M35+OlpA的多克隆抗体的酶标板、抗卡他莫拉菌表面蛋白McaP+OmpCD多克隆抗体、卡他莫拉菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液;所述卡他莫拉菌阳性对照是灭活的卡他莫拉菌菌液;所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液;所述洗涤液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠8.5g/L,Tween‑20 0.5mL/L,所述洗涤液的pH=7.4;所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG;所述酶显色底物是TMB显色液;所述终止液是1M HCL溶液;

所述包被抗卡他莫拉菌表面蛋白M35+OlpA的多克隆抗体的酶标板的制备方法是:

1)制备抗卡他莫拉菌表面蛋白M35+OlpA多克隆抗体;

2)抗卡他莫拉菌表面蛋白M35+OlpA多克隆抗体的包被:用PBS缓冲液将步骤1)制备得到的抗卡他莫拉菌表面蛋白M35+OlpA多克隆抗体稀释至浓度为10μg/mL,按100μL/孔的量包被96孔EIA高效结合酶标板,37℃2小时;取出后用250μL洗涤液洗板三次,甩干;用含有1%BSA的洗涤液作为封闭液,按250μL/孔的量加入酶标板,

37℃封闭1小时;取出后用250μL洗涤液洗板3次,每次一分钟,甩干,干燥后密封保存;

其中,所述PBS缓冲液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠

8.5g/L;所述PBS缓冲液的pH是7.4;

所述洗涤液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠8.5g/L,Tween‑20 0.5mL/L,所述洗涤液的pH是7.4;

所述封闭液是含1%BSA的洗涤液的水溶液,所述封闭液的pH是7.4。