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专利号: 2018115660106
申请人: 湖北工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种流感嗜血杆菌表面蛋白D15及Pe,其特征在于:所述流感嗜血杆菌表面蛋白D15及Pe的蛋白质序列是:

MQRVTDNDVANIVRSLFVSGRFDDVKAHQEGDVLVVSVVAKSIISDVKIKGNSIIPTEALKQNLDANGFKVGDVLIREKLNEFAKSVKEHYASVGRYNATVEPIVNTLPNNRAEILIQINEDDKAKLASLTFKGNESVSSSTLQEQMELQPDSWWKLWGNKFEGAQFEKDLQSIRDYYLNNGYAKGGSGGSGGSGGSLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKH;

用于编码所述流感嗜血杆菌表面蛋白D15及Pe的蛋白质的基因全序列是:CATATGCAGCGCGTAACCGACAACGACGTTGCAAACATCGTACGTTCTCTGTTTGTGTCCGGCCGTTTCGATGACGTTAAAGCTCACCAGGAAGGTGATGTTCTGGTTGTTTCTGTTGTTGCAAAATCCATCATCAGTGACGTTAAAATCAAGGGCAACTCTATCATCCCAACTGAAGCTCTGAAGCAGAACCTGGACGCTAACGGTTTTAAAGTAGGTGATGTTCTGATCCGTGAAAAGCTGAACGAATTCGCTAAATCCGTTAAGGAGCATTATGCGAGTGTTGGTCGTTACAACGCTACCGTAGAACCGATTGTTAACACTCTGCCGAACAACCGCGCGGAAATCCTGATCCAGATCAACGAAGATGATAAAGCAAAACTGGCTTCTCTGACCTTCAAAGGTAACGAATCTGTATCCTCATCCACTCTTCAGGAACAGATGGAACTGCAGCCGGACTCTTGGTGGAAGCTGTGGGGCAACAAATTCGAAGGCGCGCAGTTCGAAAAAGACCTGCAATCTATTCGTGATTATTACCTGAACAACGGTTATGCAAAAGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTCTGGTAAAAAACGTTAACTACTACATCGACTCTGAATCCATCTGGGTTGATAACCAGGAACCACAGATCGTACACTTCGACGCTGTTGTTAACCTCGATAAAGGCCTGTACGTTTACCCGGAACCAAAGCGTTACGCTCGTTCTGTTCGTCAGTACAAAATCCTTAACTGTGCGAACTACCATCTGACCCAGGTACGTACCGACTTTTACGACGAATTCTGGGGTCAGGGCCTGCGCGCAGCTCCGAAAAAACAGAAAAAACACTAAGGATCC。

2.一种用于制备如权利要求1所述的流感嗜血杆菌表面蛋白D15及Pe的方法,其特征在于:所述方法是:

分别获取流感嗜血杆菌表面蛋白D15及表面蛋白Pe胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到流感嗜血杆菌表面蛋白D15及表面蛋白Pe胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段基因编码序列,优化肽段基因编码序列,并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接,形成融合基因;所述流感嗜血杆菌表面蛋白D15及表面蛋白Pe在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为AAX87955及AGT37361;所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs;同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为D15pe;

所述D15pe的基因全序列是:CATATGCAGCGCGTAACCGACAACGACGTTGCAAACATCGTACGTTCTCTGTTTGTGTCCGGCCGTTTCGATGACGTTAAAGCTCACCAGGAAGGTGATGTTCTGGTTGTTTCTGTTGTTGCAAAATCCATCATCAGTGACGTTAAAATCAAGGGCAACTCTATCATCCCAACTGAAGCTCTGAAGCAGAACCTGGACGCTAACGGTTTTAAAGTAGGTGATGTTCTGATCCGTGAAAAGCTGAACGAATTCGCTAAATCCGTTAAGGAGCATTATGCGAGTGTTGGTCGTTACAACGCTACCGTAGAACCGATTGTTAACACTCTGCCGAACAACCGCGCGGAAATCCTGATCCAGATCAACGAAGATGATAAAGCAAAACTGGCTTCTCTGACCTTCAAAGGTAACGAATCTGTATCCTCATCCACTCTTCAGGAACAGATGGAACTGCAGCCGGACTCTTGGTGGAAGCTGTGGGGCAACAAATTCGAAGGCGCGCAGTTCGAAAAAGACCTGCAATCTATTCGTGATTATTACCTGAACAACGGTTATGCAAAAGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTCTGGTAAAAAACGTTAACTACTACATCGACTCTGAATCCATCTGGGTTGATAACCAGGAACCACAGATCGTACACTTCGACGCTGTTGTTAACCTCGATAAAGGCCTGTACGTTTACCCGGAACCAAAGCGTTACGCTCGTTCTGTTCGTCAGTACAAAATCCTTAACTGTGCGAACTACCATCTGACCCAGGTACGTACCGACTTTTACGACGAATTCTGGGGTCAGGGCCTGCGCGCAGCTCCGAAAAAACAGAAAAAACACTAAGGATCC;

所述D15pe基因编码的蛋白质序列是:MQRVTDNDVANIVRSLFVSGRFDDVKAHQEGDVLVVSVVAKSIISDVKIKGNSIIPTEALKQNLDANGFKVGDVLIREKLNEFAKSVKEHYASVGRYNATVEPIVNTLPNNRAEILIQINEDDKAKLASLTFKGNESVSSSTLQEQMELQPDSWWKLWGNKFEGAQFEKDLQSIRDYYLNNGYAKGGSGGSGGSGGSLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKH;

所述D15pe基因编码的蛋白质序列为流感嗜血杆菌表面蛋白D15的50‑233aa及表面蛋白Pe的43‑130aa;两段蛋白序列中间以柔性连接肽ggsggsggsggs进行连接;

将D15pe的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET‑28a(+),转入E.coli 

2+

BL21DE3菌中,用IPTG诱导重组大肠杆菌表达,用Ni 亲和层析法纯化重组D15pe蛋白。

3.一种用于制备抗流感嗜血杆菌表面蛋白D15及Pe多克隆抗体的方法,其特征在于:所述方法是将如权利要求2所述的重组D15pe蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔,抽血进行效价测定,分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化,最终获得抗流感嗜血杆菌表面蛋白D15及Pe多克隆抗体。

4.一种流感嗜血杆菌表面蛋白Pcp及PilA,其特征在于:所述流感嗜血杆菌表面蛋白Pcp及PilA的蛋白质序列是:

MRPVKIQADNQGVIGTLGGGALGGIAGSAIGGGRGQVIAAVVGAIGGAVAGSKIEEKVSQVNGAELVIKKDDGQEIVVVQKADSSFVAGRRVRIVGGGSNLNVSVLEAAAAKEAAAAKLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWTTTCKG;

用于编码所述流感嗜血杆菌表面蛋白Pcp及PilA的蛋白质的基因全序列是:CATATGCGCCCGGTTAAAATCCAGGCTGATAACCAGGGTGTAATCGGCACCCTGGGCGGCGGCGCTCTGGGCGGTATCGCAGGTTCTGCTATCGGCGGCGGTCGCGGCCAGGTTATTGCCGCTGTAGTAGGCGCTATCGGTGGTGCGGTGGCCGGTTCTAAAATCGAAGAAAAGGTTTCCCAGGTAAACGGTGCTGAGCTGGTAATCAAAAAAGACGATGGCCAGGAAATAGTTGTTGTACAGAAAGCCGACTCTTCCTTTGTAGCAGGTCGTCGCGTGCGCATCGTTGGTGGTGGGTCTAACCTGAACGTCTCTGTTCTGGAAGCTGCTGCTGCTAAAGAAGCTGCTGCTGCTAAACTGATTGAACTGATGATCGTGATCGCGATCATCGCAATTCTGGCGACCATCGCAATCCCGTCTTACCAGAACTACACTAAAAAAGCTGCTGTCTCCGAACTGCTGCAAGCATCTGCTCCGTACAAAGCTGACGTTGAACTCTGCGTTTACTCTACGAACGAGACCACCAACTGCACTGGTGGCAAAAACGGTATTGCGGCTGACATCACCACTGCTAAGGGTTACGTAAAATCTGTTACCACCTCTAACGGCGCAATCACTGTGAAAGGGGACGGCACCCTGGCTAACATGGAATACATTCTGCAGGCTACCGGTAACGCAGCGACCGGCGTGACCTGGACTACCACCTGCAAAGGCTAAGGATCC。

5.用于制备如权利要求4所述的流感嗜血杆菌表面蛋白Pcp及PilA的方法,其特征在于:所述方法是:

分别获取流感嗜血杆菌表面蛋白Pcp及表面蛋白PilA胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到流感嗜血杆菌表面蛋白Pcp及表面蛋白PilA胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段基因编码序列,优化肽段基因编码序列,并将优化后的肽段基因编码序列用刚性连接肽的编码序列进行连接,形成融合基因;所述流感嗜血杆菌表面蛋白Pcp及表面蛋白PilA在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为AAX88288及AAX12377;所述刚性连接肽的序列是eaaakeaaak;同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为pcppil;

所述pcppil的基因全序列是:CATATGCGCCCGGTTAAAATCCAGGCTGATAACCAGGGTGTAATCGGCACCCTGGGCGGCGGCGCTCTGGGCGGTATCGCAGGTTCTGCTATCGGCGGCGGTCGCGGCCAGGTTATTGCCGCTGTAGTAGGCGCTATCGGTGGTGCGGTGGCCGGTTCTAAAATCGAAGAAAAGGTTTCCCAGGTAAACGGTGCTGAGCTGGTAATCAAAAAAGACGATGGCCAGGAAATAGTTGTTGTACAGAAAGCCGACTCTTCCTTTGTAGCAGGTCGTCGCGTGCGCATCGTTGGTGGTGGGTCTAACCTGAACGTCTCTGTTCTGGAAGCTGCTGCTGCTAAAGAAGCTGCTGCTGCTAAACTGATTGAACTGATGATCGTGATCGCGATCATCGCAATTCTGGCGACCATCGCAATCCCGTCTTACCAGAACTACACTAAAAAAGCTGCTGTCTCCGAACTGCTGCAAGCATCTGCTCCGTACAAAGCTGACGTTGAACTCTGCGTTTACTCTACGAACGAGACCACCAACTGCACTGGTGGCAAAAACGGTATTGCGGCTGACATCACCACTGCTAAGGGTTACGTAAAATCTGTTACCACCTCTAACGGCGCAATCACTGTGAAAGGGGACGGCACCCTGGCTAACATGGAATACATTCTGCAGGCTACCGGTAACGCAGCGACCGGCGTGACCTGGACTACCACCTGCAAAGGCTAAGGATCC;

所述pcppil基因编码的蛋白质序列是:MRPVKIQADNQGVIGTLGGGALGGIAGSAIGGGRGQVIAAVVGAIGGAVAGSKIEEKVSQVNGAELVIKKDDGQEIVVVQKADSSFVAGRRVRIVGGGSNLNVSVLEAAAAKEAAAAKLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWTTTCKG;

所述pcppil基因编码的蛋白质序列为流感嗜血杆菌表面蛋白Pcp的50‑154aa及表面蛋白PilA的17‑133aa;两段蛋白序列中间以刚性连接肽eaaakeaaak进行连接;

将pcppil的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET‑28a(+),转入E.coli 

2+

BL21DE3菌中,用IPTG诱导重组大肠杆菌表达,用Ni 亲和层析法纯化重组Pcppil蛋白。

6.一种用于制备抗流感嗜血杆菌表面蛋白Pcp及PilA多克隆抗体的方法,其特征在于:所述方法是:将如权利要求5所述的重组Pcppil蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔,抽血进行效价测定,分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化,最终获得抗流感嗜血杆菌Pcp及PilA蛋白多克隆抗体,用封闭液稀释至终浓度为20μg/mL;

所述封闭液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠8.5g/L,牛血清白蛋白10g/L,所述封闭液的pH是7.4。

7.一种基于流感嗜血杆菌表面蛋白抗体的流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒,其特征在于:所述基于流感嗜血杆菌表面蛋白抗体的流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒包括包被有如权利要求3制备得到的抗流感嗜血杆菌表面蛋白D15及Pe的多克隆抗体的酶标板、如权利要求5制备得到的抗流感嗜血杆菌表面蛋白Pcp及PilA多克隆抗体、流感嗜血杆菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液;所述流感嗜血杆菌阳性对照是灭活的流感嗜血杆菌菌液;所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液;所述洗涤液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠8.5g/L,Tween‑200.5mL/L,所述洗涤液的pH=7.4;所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG;所述酶显色底物是TMB显色液;

所述终止液是1M HCL溶液。

8.一种基于如权利要求7所述的基于流感嗜血杆菌表面蛋白抗体的流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述基于流感嗜血杆菌表面蛋白抗体的流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒包括包被如权利要求3制备得到的抗流感嗜血杆菌表面蛋白D15及Pe的多克隆抗体的酶标板、如权利要求5制备得到的抗流感嗜血杆菌表面蛋白Pcp及PilA多克隆抗体、流感嗜血杆菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液;

所述流感嗜血杆菌阳性对照是灭活的流感嗜血杆菌菌液;所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液;所述洗涤液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠8.5g/L,Tween‑200.5mL/L,所述洗涤液的pH=7.4;所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG;所述酶显色底物是TMB显色液;所述终止液是1M HCL溶液;

所述包被抗流感嗜血杆菌表面蛋白D15及Pe的多克隆抗体的酶标板的制备方法是:

1)制备抗流感嗜血杆菌表面蛋白D15及Pe多克隆抗体;

2)抗流感嗜血杆菌表面蛋白D15及Pe多克隆抗体的包被:用PBS缓冲液将步骤1)制备得到的抗流感嗜血杆菌表面蛋白D15及Pe多克隆抗体稀释至浓度为10μg/mL,按100μL/孔的量包被96孔EIA高效结合酶标板,37℃2小时;取出后用250μL洗涤液洗板三次,甩干;用含有1%BSA的洗涤液作为封闭液,按250μL/孔的量加入酶标板,37℃封闭1小时;取出后用250μL洗涤液洗板3次,每次一分钟,甩干,干燥后密封保存;

其中,所述PBS缓冲液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠

8.5g/L;所述PBS缓冲液的pH是7.4;

所述洗涤液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠8.5g/L,Tween‑200.5mL/L,所述洗涤液的pH是7.4;

所述封闭液是含1%BSA的洗涤液的水溶液,所述封闭液的pH是7.4。