1.一种肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ),其特征在于:所述肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)的蛋白质序列是:MEIEKSGTLKVATEDDYAPFNFMNNGQADGFNKDMLEELRKYAKFHVDQSILPWTGLLAAVSTGQYDMALTGAVITDERLKVFDFTPPWASAQHYFVKRAGDTSLNTIADLSGKKVGVQAGSALLARLPELKAMLEKTGGKLGPVVEYPSYPEAYADLANKRLDYVINVVISVNDLAKAKPKVFGGSGGSGGSGGSDRLVVLHDHYLDRVTDVAQRFPQRARKDGRFYAIDFTLDEIKSLKFTEGFEPKNGKNVQTYPGRFPMGKSDFRIHTFEEEIEFVQGLNHSTGKNIGIYPEIKAPWFHHQEGKDIAASTLKVLKEYGYTSKQDKVYLQCFDANELKRIKNELEPKMGMDLNLVQL;
用于编码肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)的蛋白质的基因全序列是:
CATATGGAAATCGAAAAAAGCGGTACTCTGAAAGTTGCAACCGAGGACGACTATGCACCGTTCAACTTCATGAACAACGGCCAAGCTGACGGCTTCAACAAAGACATGCTGGAAGAACTGCGTAAGTATGCGAAATTCCATGTGGACCAAAGCATCCTGCCGTGGACTGGCCTGCTGGCAGCCGTATCTACTGGCCAGTACGACATGGCACTGACCGGCGCAGTTATCACCGACGAACGTCTGAAAGTTTTCGACTTCACTCCGCCGTGGGCATCCGCTCAGCATTACTTCGTTAAACGTGCAGGCGACACCTCTCTGAACACTATTGCAGACTTGTCCGGTAAGAAAGTTGGCGTACAGGCAGGTAGCGCTCTGCTGGCACGTCTGCCGGAACTGAAAGCAATGCTGGAGAAAACTGGCGGTAAATTAGGCCCGGTGGTTGAATATCCGTCTTACCCGGAAGCATACGCTGACCTGGCTAACAAACGTCTGGATTATGTTATCAACGTTGTTATCTCCGTTAACGACCTGGCAAAAGCTAAACCGAAGGTTTTCGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGACCGTCTGGTTGTACTGCACGATCATTACTTGGACCGTGTTACTGACGTTGCTCAGCGCTTCCCTCAGCGTGCGCGCAAAGACGGTCGTTTTTACGCTATCGACTTTACCCTGGATGAAATCAAATCTCTCAAATTCACTGAAGGTTTCGAGCCTAAAAACGGCAAAAACGTTCAAACCTATCCTGGTCGTTTCCCGATGGGTAAAAGCGATTTTCGCATCCACACTTTCGAAGAGGAAATCGAATTCGTACAGGGTCTCAACCACTCTACTGGTAAAAACATCGGTATCTACCCGGAAATCAAAGCACCGTGGTTCCACCACCAGGAAGGTAAAGACATCGCTGCTTCCACCCTCAAAGTTCTGAAAGAATACGGTTACACCTCTAAGCAGGATAAAGTGTACCTGCAGTGCTTCGACGCTAATGAACTGAAGCGTATCAAAAACGAACTGGAGCCGAAAATGGGCATGGACCTGAACCTGGTACAGCTGTAAGGATCC。
2.一种用于制备如权利要求1所述的肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)的方法,其特征在于:所述制备方法是:
分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transporter substrate-binding protein receptor及表面蛋白GlpQ胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列,优化肽段基因编码序列,并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接,形成融合基因;所述肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transporter substrate-binding protein receptor及表面蛋白GlpQ在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_009653190及WP_004214637;所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs;同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为Abcglp;
所述Abcglp的基因全序列是:
CATATGGAAATCGAAAAAAGCGGTACTCTGAAAGTTGCAACCGAGGACGACTATGCACCGTTCAACTTCATGAACAACGGCCAAGCTGACGGCTTCAACAAAGACATGCTGGAAGAACTGCGTAAGTATGCGAAATTCCATGTGGACCAAAGCATCCTGCCGTGGACTGGCCTGCTGGCAGCCGTATCTACTGGCCAGTACGACATGGCACTGACCGGCGCAGTTATCACCGACGAACGTCTGAAAGTTTTCGACTTCACTCCGCCGTGGGCATCCGCTCAGCATTACTTCGTTAAACGTGCAGGCGACACCTCTCTGAACACTATTGCAGACTTGTCCGGTAAGAAAGTTGGCGTACAGGCAGGTAGCGCTCTGCTGGCACGTCTGCCGGAACTGAAAGCAATGCTGGAGAAAACTGGCGGTAAATTAGGCCCGGTGGTTGAATATCCGTCTTACCCGGAAGCATACGCTGACCTGGCTAACAAACGTCTGGATTATGTTATCAACGTTGTTATCTCCGTTAACGACCTGGCAAAAGCTAAACCGAAGGTTTTCGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGACCGTCTGGTTGTACTGCACGATCATTACTTGGACCGTGTTACTGACGTTGCTCAGCGCTTCCCTCAGCGTGCGCGCAAAGACGGTCGTTTTTACGCTATCGACTTTACCCTGGATGAAATCAAATCTCTCAAATTCACTGAAGGTTTCGAGCCTAAAAACGGCAAAAACGTTCAAACCTATCCTGGTCGTTTCCCGATGGGTAAAAGCGATTTTCGCATCCACACTTTCGAAGAGGAAATCGAATTCGTACAGGGTCTCAACCACTCTACTGGTAAAAACATCGGTATCTACCCGGAAATCAAAGCACCGTGGTTCCACCACCAGGAAGGTAAAGACATCGCTGCTTCCACCCTCAAAGTTCTGAAAGAATACGGTTACACCTCTAAGCAGGATAAAGTGTACCTGCAGTGCTTCGACGCTAATGAACTGAAGCGTATCAAAAACGAACTGGAGCCGAAAATGGGCATGGACCTGAACCTGGTACAGCTGTAAGGATCC;
所述Abcglp基因编码的蛋白质序列是:
MEIEKSGTLKVATEDDYAPFNFMNNGQADGFNKDMLEELRKYAKFHVDQSILPWTGLLAAVSTGQYDMALTGAVITDERLKVFDFTPPWASAQHYFVKRAGDTSLNTIADLSGKKVGVQAGSALLARLPELKAMLEKTGGKLGPVVEYPSYPEAYADLANKRLDYVINVVISVNDLAKAKPKVFGGSGGSGGSGGSDRLVVLHDHYLDRVTDVAQRFPQRARKDGRFYAIDFTLDEIKSLKFTEGFEPKNGKNVQTYPGRFPMGKSDFRIHTFEEEIEFVQGLNHSTGKNIGIYPEIKAPWFHHQEGKDIAASTLKVLKEYGYTSKQDKVYLQCFDANELKRIKNELEPKMGMDLNLVQL;
所述Abcglp基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transporter substrate-binding protein receptor的29-211aa及表面蛋白GlpQ的69-232aa;两段蛋白序列中间以柔性连接肽ggsggsggsggs进行连接;
将Abcglp的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+),转入E.coli BL21(DE3)菌中,用IPTG诱导重组大肠杆菌表达,用Ni2+亲和层析法纯化重组His-Abcglp蛋白。
3.一种用于制备抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)多克隆抗体的方法,其特征在于:所述方法是将如权利要求2所述的重组His-Abcglp蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔,抽血进行效价测定,分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化,最终获得抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)多克隆抗体。
4.一种肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD),其特征在于:所述肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)的蛋白质序列是:
MNDYRNKIEAGYAPVYQNNKGTDLYQWENVPKAVVEGLEGTLNVPVSETVNWTNNITYMLQSKNKETGDRLSIIPEYTLNSTLSWQVRDDVSLQSTFTWYGKQEPKKYNYKGQPVTGSEKNEVSPYSILGLSATWDVTKYVSLTGGVEAAAAKEAAAAKLDSPVDISQLADMAGMPVSKLKTFNAGVKGSTLGASGPKYVMVPQKHAAQLRESLASGDIAAVQPTQLADNTPLTSRSYKVRSGDTISGIASRLGVTTRDLQQWNNLRGSGLKVGQNLVIGAGSSAQRLANNSDSITYRVRKGDSLSSIA;
用于编码所述肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)的蛋白质的基因全序列是:
CATATGAACGATTACCGTAACAAAATCGAAGCAGGTTACGCTCCGGTTTACCAGAACAACAAAGGTACCGACCTGTACCAGTGGGAGAACGTTCCGAAAGCGGTAGTAGAAGGCCTGGAAGGCACTCTGAACGTCCCAGTTTCCGAGACCGTAAACTGGACCAACAACATCACTTACATGCTGCAGAGCAAGAACAAGGAAACAGGCGACCGCCTGTCTATCATCCCGGAATATACCCTGAACTCTACTCTGAGCTGGCAGGTACGTGATGACGTATCCCTGCAGTCTACCTTCACCTGGTACGGCAAACAGGAACCGAAGAAATACAACTACAAAGGCCAGCCGGTTACCGGTTCTGAAAAAAACGAAGTATCCCCGTACTCTATCCTGGGTCTGTCCGCAACATGGGACGTTACTAAGTATGTCTCTCTGACCGGTGGCGTAGAAGCTGCTGCTGCTAAAGAAGCTGCTGCTGCTAAACTGGACTCTCCGGTAGACATCTCCCAGCTGGCAGACATGGCTGGTATGCCGGTATCCAAACTGAAGACCTTCAACGCAGGTGTTAAGGGCTCCACTCTGGGCGCATCTGGTCCGAAATACGTAATGGTACCGCAGAAACACGCAGCTCAGCTGCGTGAATCCCTGGCATCTGGCGATATCGCAGCTGTACAGCCGACCCAGCTGGCTGACAACACTCCCCTGACCTCTCGTTCCTACAAAGTACGCAGCGGCGATACTATCTCTGGTATTGCTTCCCGCCTGGGCGTGACTACTCGTGACCTCCAGCAGTGGAACAACCTGCGTGGCTCTGGTCTGAAAGTTGGCCAGAACCTGGTGATCGGTGCTGGCTCCAGCGCACAGCGTCTGGCCAACAACTCTGATTCTATCACATACCGCGTACGTAAGGGTGACTCTCTGTCCTCTATCGCTTAAGGATCC。
5.一种用于制备如权利要求4所述的肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)的方法,其特征在于:所述方法是:
分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA及表面蛋白MltD胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列,优化肽段基因编码序列,并将优化后的肽段基因编码序列用刚性连接肽的编码序列进行连接,形成融合基因;所述肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA及表面蛋白MltD在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_012068422及WP_004210407;所述刚性连接肽的序列是eaaakeaaak;同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为Fepmlt;
所述Fepmlt的基因全序列是:
CATATGAACGATTACCGTAACAAAATCGAAGCAGGTTACGCTCCGGTTTACCAGAACAACAAAGGTACCGACCTGTACCAGTGGGAGAACGTTCCGAAAGCGGTAGTAGAAGGCCTGGAAGGCACTCTGAACGTCCCAGTTTCCGAGACCGTAAACTGGACCAACAACATCACTTACATGCTGCAGAGCAAGAACAAGGAAACAGGCGACCGCCTGTCTATCATCCCGGAATATACCCTGAACTCTACTCTGAGCTGGCAGGTACGTGATGACGTATCCCTGCAGTCTACCTTCACCTGGTACGGCAAACAGGAACCGAAGAAATACAACTACAAAGGCCAGCCGGTTACCGGTTCTGAAAAAAACGAAGTATCCCCGTACTCTATCCTGGGTCTGTCCGCAACATGGGACGTTACTAAGTATGTCTCTCTGACCGGTGGCGTAGAAGCTGCTGCTGCTAAAGAAGCTGCTGCTGCTAAACTGGACTCTCCGGTAGACATCTCCCAGCTGGCAGACATGGCTGGTATGCCGGTATCCAAACTGAAGACCTTCAACGCAGGTGTTAAGGGCTCCACTCTGGGCGCATCTGGTCCGAAATACGTAATGGTACCGCAGAAACACGCAGCTCAGCTGCGTGAATCCCTGGCATCTGGCGATATCGCAGCTGTACAGCCGACCCAGCTGGCTGACAACACTCCCCTGACCTCTCGTTCCTACAAAGTACGCAGCGGCGATACTATCTCTGGTATTGCTTCCCGCCTGGGCGTGACTACTCGTGACCTCCAGCAGTGGAACAACCTGCGTGGCTCTGGTCTGAAAGTTGGCCAGAACCTGGTGATCGGTGCTGGCTCCAGCGCACAGCGTCTGGCCAACAACTCTGATTCTATCACATACCGCGTACGTAAGGGTGACTCTCTGTCCTCTATCGCTTAAGGATCC;
所述Fepmlt基因编码的蛋白质序列是:
MNDYRNKIEAGYAPVYQNNKGTDLYQWENVPKAVVEGLEGTLNVPVSETVNWTNNITYMLQSKNKETGDRLSIIPEYTLNSTLSWQVRDDVSLQSTFTWYGKQEPKKYNYKGQPVTGSEKNEVSPYSILGLSATWDVTKYVSLTGGVEAAAAKEAAAAKLDSPVDISQLADMAGMPVSKLKTFNAGVKGSTLGASGPKYVMVPQKHAAQLRESLASGDIAAVQPTQLADNTPLTSRSYKVRSGDTISGIASRLGVTTRDLQQWNNLRGSGLKVGQNLVIGAGSSAQRLANNSDSITYRVRKGDSLSSIA;
所述Fepmlt基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA的550-695aa及表面蛋白MltD的268-417aa;两段蛋白序列中间以刚性连接肽eaaakeaaak进行连接;
将Fepmlt的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+),转入E.coli BL21(DE3)菌中,用IPTG诱导重组大肠杆菌表达,用Ni2+亲和层析法纯化重组His-Fepmlt蛋白。
6.一种用于制备抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)多克隆抗体的方法,其特征在于:所述方法是将如权利要求5所述的重组His-Fepmlt蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔,抽血进行效价测定,分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化,最终获得抗肺炎克雷伯菌FepA及MltD蛋白多克隆抗体,用封闭液稀释至终浓度为
20μg/mL;所述封闭液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠
8.5g/L,牛血清白蛋白10g/L,所述封闭液的pH是7.4。
7.一种基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒,其特征在于:所述基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒包括包被抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)的多克隆抗体的酶标板、抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)多克隆抗体、肺炎克雷伯菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液;所述肺炎克雷伯菌阳性对照是灭活的肺炎克雷伯菌菌液;所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液;所述洗涤液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠8.5g/L,Tween-20 0.5mL/L,所述洗涤液的pH=7.4;所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG;所述酶显色底物是TMB显色液;所述终止液是1M HCL溶液。
8.一种基于权利要求7所述的肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒包括包被抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)的多克隆抗体的酶标板、抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)多克隆抗体、肺炎克雷伯菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液;所述肺炎克雷伯菌阳性对照是灭活的肺炎克雷伯菌菌液;所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液;所述洗涤液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠8.5g/L,Tween-200.5mL/L,所述洗涤液的pH=7.4;所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG;所述酶显色底物是TMB显色液;所述终止液是1M HCL溶液;
所述包被抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)的多克隆抗体的酶标板的制备方法是:
1)制备抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)多克隆抗体;
2)抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)多克隆抗体的包被:
用PBS缓冲液将步骤1)制备得到的抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)多克隆抗体稀释至浓度为10μg/mL,按100μL/孔的量包被96孔EIA高效结合酶标板,37℃2小时;取出后用250μL洗涤液洗板三次,甩干;
用含有1%BSA的洗涤液作为封闭液,按250μL/孔的量加入酶标板,37℃封闭1小时;取出后用250μL洗涤液洗板3次,每次一分钟,甩干,干燥后密封保存;
其中,所述PBS缓冲液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠
8.5g/L;所述PBS缓冲液的pH是7.4;
所述洗涤液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2g/L,氯化钠8.5g/L,Tween-20 0.5mL/L,所述洗涤液的pH是7.4;
所述封闭液是含1%BSA的洗涤液的水溶液,所述封闭液的pH是7.4。