1.一种采用冷冻保存液对宽体沙鳅精液进行超低温保存的方法,其特征在于,冷冻保存液包括稀释剂和抗冻剂,所述稀释剂由以下组分组成:NaCl 34g/L、KCl 0.38g/L、海藻糖
24g/L、蔗糖32g/L、牛磺酸22mM和辅酶A0.16mM;
所述抗冻剂由二甲基亚砜、甘油和甲醇组成;
具体保存方法如下:
(1)取性成熟雄鱼,吸干其生殖孔表面及周围的水分,然后由前往后压鱼腹两侧,收集精液,冰浴备用;
(2)取NaCl、KCl、海藻糖、蔗糖、牛磺酸和辅酶A混合均匀、备用;
(3)将步骤(1)收集的精液与步骤(2)制得的稀释剂以1:3 7的体积比稀释并混合均匀,~
备用;
(4)先向步骤(3)制得的精液中添加甲醇至终浓度为2 4%,然后在4 6℃条件下保温6 8~ ~ ~
分钟,再向精液中添加甘油至终浓度为1 4%,然后在4 6℃条件下保温6 8分钟,最后向精液~ ~ ~
中添加二甲基亚砜至终浓度为8 11%,得混合精液;
~
(5)将步骤(4)中制得的混合精液分装于冷存管中;
(6)将步骤(5)中的冷存管依次在2 6℃条件下孵育20 40分钟,‑2 4℃条件下孵育5 20~ ~ ~ ~
分钟,‑30 ‑10℃条件下孵育10 20分钟,‑50 ‑40℃条件下孵育10 20分钟,然后在‑95 ‑80~ ~ ~ ~ ~
℃条件中保存。
2.如权利要求1所述的宽体沙鳅精液超低温保存的方法,其特征在于,步骤(1)中收集的精液活率在85%以上。
3.如权利要求1所述的宽体沙鳅精液超低温保存的方法,其特征在于,步骤(3)中精液与稀释剂的体积比为1:3。
4.如权利要求1所述的宽体沙鳅精液超低温保存的方法,其特征在于,步骤(4)中先向精液中添加甲醇至终浓度为2%,然后在4℃条件下保温8分钟,再向精液中添加甘油至终浓度为1%,然后在4℃条件下保温6分钟,最后向精液中添加二甲基亚砜至终浓度为10%,备用。
5.如权利要求1所述的宽体沙鳅精液超低温保存的方法,其特征在于,步骤(5)中的冷存管依次在4℃条件下中孵育30分钟,0℃孵育10分钟,‑20℃孵育15分钟,‑43℃孵育15分钟,然后在‑87℃条件中保存。