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专利号: 2018115996954
申请人: 浙江理工大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种丝绸文物的高灵敏度检测方法,其特征在于包括以下步骤:

A)取蚕茧并取出内部的蚕蛹,去除最内层的蛹衬;将所得蚕茧壳加入Na2CO3脱胶液中搅拌,并重复该操作多次以充分除去丝胶;将不溶的丝素用去离子水洗多次,烘干,备用;

B)将烘干的丝素加入蛋白提取液中搅拌溶解;将溶有丝素的蛋白提取液在常温下冷却过滤后,用截留分子量为10000的纤维素透析袋在去离子水中透析以去除钙离子和氯离子,得到纯化的丝素蛋白溶液;将丝素蛋白溶液真空冷冻干燥,得到丝素蛋白,研磨成粉末后密封瓶备用;

C)取一根玻碳电极,将去除污渍的玻碳电极在麂皮上依次用1.0μm、0.3μm、0.05 μm的氧化铝悬浮液中进行8字形打磨;接下来依次在无水乙醇和蒸馏水中超声洗涤;

D)将洗净的玻碳电极浸泡在0.4-0.6M的稀硫酸溶液中,在电化学工作站上利用循环伏安法循环活化35-45周,循环伏安法的扫描范围为-0.4V-1.6V,扫描速率为0.08-0.12V/s;

E)配制得到PBS 7.4溶液,称取 K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]、KCl,加入PBS 7.4溶液,得到[Fe(CN)6]3-/4-浓度为4.5-5.5 mM的铁氰化钾溶液;

F)分别配制十六烷基三甲基溴化铵溶液、HAuCl4溶液和NaBH4溶液;将十六烷基三甲基溴化铵溶液添加于离心管中,在震荡作用下向其中加入HAuCl4溶液;再在震荡作用下,快速加入NaBH4溶液,剧烈震荡,静置,得到金纳米颗粒溶液;

G)按体积比50-70:80-100:8-12将0.15-0.25 mg/mL的聚丙烯酸溶液、1.5-2.5 mol/L的氨水和水混合,超声震荡,然后加入异丙醇,搅拌均匀,静置后1-5℃保存;

H)按体积比5-7:8-12:8-12将步骤G)所得溶液、水,和异丙醇混合,随后加入多巴胺溶液,静置,得到中空结构的聚丙烯酸-多巴胺复合物溶液;

I)称取质量比为110-130:70-90的聚甲基丙烯酸甲酯和马来酸酐/1-十八碳烯交替共聚物,加入三氯甲烷和十二烷基磺酸钠溶液,所得混合液超声震荡,离心,除去上清液,剩余产物用水洗涤多次,得到球形纳米珠,最后加入三氯甲烷中制得溶液,备用;

J)取步骤D)处理后的玻碳电极,滴加35-45 μL步骤F)中所得金纳米颗粒溶液于玻碳电极表面,室温干燥后,将电极浸泡0.2-0.3M的巯基丙酸中5-7h,然后彻底洗涤,将玻碳电极在NHS/EDC溶液浸泡中0.5-1.5h;然后将玻碳电极洗涤后在其表面滴加25-35 μL步骤H)所得溶液,室温干燥后洗涤,将玻碳电极在NHS/EDC溶液中浸泡20-40min;彻底洗涤后在玻碳电极表面继续滴加25-35μL步骤I)所得溶液,室温干燥,在NHS/EDC溶液中浸泡20-40min;最后在玻碳电极表面滴加8-12 μL鼠抗丝素蛋白单克隆抗体,35-39℃孵育0.5-1.5h;

K)用步骤B)中所得的丝素蛋白配制不同浓度的溶液,滴加15-25 μL于步骤J)处理完的玻碳电极表面,35-39℃孵育0.5-1.5h,洗涤后在电化学工作站上用差分脉冲伏安法扫描测试,扫描范围为-0.2V-0.6V;

L)称取文物样,用步骤B)中所述蛋白提取液溶解,按步骤K)所用方法测试。

2.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法,其特征在于,步骤A)中,将所得蚕茧壳加入质量分数为0.4%-0.6%的Na2CO3脱胶液中,在浴比为1:45-1:55、温度为98 ± 2 ℃的条件下搅拌20-40min;烘干温度为 55-65 °C。

3.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法,其特征在于,步骤B)中,所述蛋白提取液由摩尔比为1:7-9:1-3的氯化钙、水和乙醇组成;丝素与蛋白提取液的浴比为

1:45-1:55,搅拌溶解条件为在98 ± 2 ℃下搅1.5-2.5 h;透析期间并每隔3-5 h换一次水,透析时间为60-80 h;真空冷冻干燥时间为60-80 h。

4.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法,其特征在于,步骤C)中,玻碳电极的直径位2-4mm,打磨时间为8-12min;超声洗涤时间为8-12min。

5.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法,其特征在于,步骤F)的具体过程为:取3.6445 g十六烷基三甲基溴化铵于锥形瓶中,加入100 mL水,在35-39℃水浴中搅拌溶解;取2.057mL、10 g/L的HAuCl4于离心管中,加入2.942 mL的水摇匀,遮光保存;按NaBH4与冻水的比例为11.4 mg:30 mL配制0.5-0.7 mL NaBH4溶液;过滤得到8-12 mL十六烷基三甲基溴化铵溶液于离心管中,在震荡作用下向其中加入0.2-0.3 mL的HAuCl4溶液;再在震荡作用下,快速加入0.5-0.7 mL的NaBH4溶液,剧烈震荡1-3 min,20-30℃下静置1.5-

2.5 h,得到金纳米颗粒溶液。

6.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法,其特征在于,步骤G)中,超声震荡时间为0.5-1.5h,搅拌时间为0.5-1.5h。

7.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法,其特征在于,步骤H)中,静置温度为45-55℃,静置时间为2-4h。

8.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法,其特征在于,步骤I)中,超声震荡时间为1-3 min,离心速率为8000-12000 rpm,离心时间为8-12min。

9.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法,其特征在于,步骤J)中,所述NHS/EDC溶液中NHS和EDC的摩尔比为0.2-0.4:0.4-0.6。

10.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法,其特征在于,步骤L)中,称取0.01-0.03 g文物样,用1-3 mL步骤B)中所述蛋白提取液溶解。