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专利号: 2018116217100
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种来源于Pseudomonas moorei的草铵膦脱氢酶突变体,其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO:6所示氨基酸序列第107位、第188位、第239位、第357位进行单突变或多位点突变获得的。

2.如权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体,其特征在于所述突变体为下列之一:第107位精氨酸突变为亮氨酸、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸、第

107位精氨酸突变为亮氨酸+第239位赖氨酸突变为甘氨酸、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸+第239位赖氨酸突变为酪氨酸、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸+第239位赖氨酸突变为半胱氨酸、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸+第239位赖氨酸突变为甘氨酸、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸+第239位赖氨酸突变为甘氨酸+第357位甘氨酸突变为苯丙氨酸。

3.如权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体,其特征在于所述突变体为第107位的精氨酸取代为亮氨酸、第188位的脯氨酸取代为苯丙氨酸、第239位的亮氨酸取代为甘氨酸、第357位的甘氨酸取代为苯丙氨酸。

4.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体的编码基因。

5.一种权利要求4所述含草铵膦脱氢酶突变体的编码基因的工程菌。

6.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体在催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸合成L-草铵膦中的应用。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述的应用以含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的粗酶液为催化剂,以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物,以葡萄糖为辅助底物,加入无机氨基供体,于pH值为7.5的缓冲液中构成转化体系,在35℃、600rpm条件下反应,反应完全,将反应液分离纯化,获得L-草铵膦。

8.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述转化体系中,催化剂的用量以湿菌体重量计为20~100g/L,所述底物的初始浓度为10~500mM,葡萄糖添加量为12-600mM,无机氨基供体添加量为50mM-1.5M。

9.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述催化剂按如下方法制备:将含有葡萄糖脱氢酶和草铵膦脱氢酶E3的重组工程菌接种至含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基,

37℃,200rpm下培养12h,再以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中,于37℃,150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8,加入终浓度为24μg/mL的IPTG,18℃下诱导培养16h后,4℃、8000rpm离心20min,弃去上清液,收集沉淀,用pH 7.5、

20mM磷酸盐缓冲液洗涤两次,即获得湿菌体;将湿菌体加入pH 7.5、100mM的PBS中重悬细胞,在冰水混合物上超声破碎10min,超声破碎条件:功率为400W,破碎1s,暂停5s,获得粗酶液。