1.能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括：(1)预扩增引物混合液；

该混合液中包括预扩增引物，其序列如SEQ ID NO：1～14所示；

(2)探针混合液；

该混合液中包括左侧探针和右侧探针，其序列如SEQ ID NO：15～28所示；

(3)MLPA缓冲液；

(4)连接缓冲液A；

(5)连接缓冲液B；

(6)连接酶Ligase-65；

(7)PCR反应混合液，其包括如序列SEQ ID NO：29和30所示的通用引物；

(8)SALSA聚合酶；

(9)阴性对照；

(10)阳性对照。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，

在所述预扩增引物混合液的预扩增引物中：序列SEQ ID NO：1和序列SEQ ID NO：2分别是禽流感病毒H9预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：3和序列SEQ ID NO：4分别是禽流感病毒H5预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：5和序列SEQ ID NO：6分别是禽流感病毒H7预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别是新城疫病毒预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10分别是禽偏肺病毒预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12分别是禽传染性支气管炎病毒预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14分别是禽传染性喉气管炎病毒预扩增的正向和反向引物；

在所述探针混合液的探针中：序列SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16分别为检测禽流感病毒H9的左侧探针和右侧探针；序列SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18分别为检测禽流感病毒H5的左侧探针和右侧探针；序列SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20分别为检测禽流感病毒H7的左侧探针和右侧探针；序列SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22分别为检测新城疫病毒的左侧探针和右侧探针；序列SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24分别为检测禽偏肺病毒的左侧探针和右侧探针；序列SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26分别为检测禽传染性支气管炎病毒的左侧探针和右侧探针；序列SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28分别为检测禽传染性喉气管炎病毒的左侧探针和右侧探针；

在所述PCR反应混合液的引物中，序列SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30分别是通用正向和反向引物；

其中，序列SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：

24、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28的5’端进行磷酸化处理。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照是基因体外转录RNA与阳性重组质粒DNA的混合物；其中基因体外转录RNA是指禽流感病毒H9的HA基因、禽流感病毒H5的HA基因、禽流感病毒H7的HA基因、新城疫病毒的M基因、禽偏肺病毒的N基因、禽传染性支气管炎病毒的M基因的体外转录RNA，阳性重组质粒DNA是指禽传染性喉气管炎病毒的糖蛋白C基因的阳性重组质粒DNA。

4.利用权利要求1所述试剂盒同时检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)磁珠法提取样品DNA/RNA；

使用磁珠DNA/RNA共提取试剂盒和全自动核酸提取仪，同时提取样品中的DNA和RNA，得到100μL样品；

(2)RNA反转录成cDNA及预扩增

进行一步法反转录RT-PCR反应；

配制25μL反应体系：10μL OneStep Ahead RT-PCR Master Mix，1μL OneStep Ahead RT-Mix，5μL DNA或RNA，5μL Q-solution，终浓度为每条引物0.25μM的预扩增引物混合液共

1μL，3μL H2O补足；反应条件：50℃10min，95℃5min；95℃15s，55℃20s，72℃20s，30个循环；

72℃2min；

(3)MLPA检测

a、DNA变性

取0.2mL PCR反应管，每管加入0.5μL DNA溶液和4.5μL TE，98℃变性5min，降至室温25℃；

b、探针与样本DNA的杂交

配制3μL混匀的探针混合液：1.5μL MLPA缓冲液+1.5μL探针混合液；将探针混合物加入上述PCR管中，95℃温育1min，60℃杂交1-16h，54℃温育；

c、杂交探针的连接

配制32μL连接酶混合物：25μL dH2O+3μL连接缓冲液A+3μL连接缓冲液B+1μL连接酶Ligase-65；PCR仪温度降至54℃，打开管盖，加入32μL连接酶混合物，54℃温育15min，98℃加热5min灭活连接酶，20℃温育；

d、连接探针的PCR扩增

配制10μL PCR混合液：7.5μL dH2O+2μL PCR反应混合液+0.5μL SALSA聚合酶；取出PCR管，室温下加入10μL PCR混合物；开始PCR反应，反应条件为：95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃孵育20min，降至15℃；

e、全自动核酸分析仪分析：

取PCR扩增产物，用全自动核酸分析仪进行分析；

(4)结果描述及判定

a、质控标准：

阳性对照在92bp、97bp、102bp、120bp、127bp、134bp、142bp处有特异性扩增条带；

阴性对照无特异性扩增条带；

如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效；

b、结果判断：

阳性：在92bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒H9；在97bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒H5；在102bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒H7；在120bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在新城疫病毒；在127bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽偏肺病毒；在134bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽传染性支气管炎病毒；在142bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽传染性喉气管炎病毒；

阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无禽流感病毒H9、禽流感病毒H5、禽流感病毒H7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在进行结果判断时，对MLPA扩增产物进行测序，进一步确认结果。