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专利号: 2019101282648
申请人: 浙江农林大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法,其特征在于:包括以下步骤:

步骤一:构建CRISPR/Cas9基因编辑载体:将荧光蛋白报告基因与编码sgRNA序列的DNA片段插入到携带CRISPR/Cas9的编辑载体中,分别构建用于检测编辑效率或脱靶效应的编辑载体;

检测所述编辑效率的编辑载体所采用的sgRNA包含两条以FDA2基因为基础设计的两条靶序列T1和T2,或者包含两条以FDA3基因为基础设计的两条靶序列T3和T4;其中,T1的碱基序列如SEQ ID NO:01所示,T2的碱基序列如SEQ ID NO:02所示,T3的碱基序列如SEQ ID NO:03所示,T4的碱基序列如SEQ ID NO:04所示;

检测所述脱靶效应的编辑载体所采用的sgRNA包含碱基序列如SEQ ID NO:05所示的FAD2的靶序列;

步骤二:将步骤一构建好的载体利用农杆菌介导法转化植株,再利用荧光光蛋白报告基因筛选植株转基因后代;

步骤三:通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组分筛选出被编辑的植株进而确定编辑效率,或计算脱靶频率:当C18:2>=39%时判定FDA3位点突变,当C18:1>=30%时判定FDA2位点突变;发生位点突变的植株数在总植株数中的占比即为编辑效率;通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组分筛选出的非预期基因突变的频率,即为脱靶频率。

2.一种CRISPR/Cas9基因编辑载体,其特征在于:包括单个sgRNA或两个sgRNA组成的表达元件、Cas9蛋白基因和mCherry荧光蛋白基因;所述mCherry荧光蛋白基因由种子特异性表达的At2S3基因启动子驱动;所述Cas9蛋白基因由卵细胞特异性表达的EC1.2基因的启动子启动;

所述sgRNA包含两条以FDA2基因为基础设计的两条靶序列T1和T2,或者包含两条以FDA3基因为基础设计的两条靶序列T3和T4;其中,T1的碱基序列如SEQ ID NO:01所示,T2的碱基序列如SEQ ID NO:02所示,T3的碱基序列如SEQ ID NO:03所示,T4的碱基序列如SEQ ID NO:04所示。

3.如权利要求2所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑载体在检测CRISPR/Cas9基因编辑系统编辑效率上的应用。

4.一种CRISPR/Cas9基因编辑载体,其特征在于:包括单个sgRNA或两个sgRNA组成的表达元件、Cas9蛋白基因和mCherry荧光蛋白基因;所述mCherry荧光蛋白基因由种子特异性表达的At2S3基因启动子驱动;所述Cas9蛋白基因由卵细胞特异性表达的EC1.2基因的启动子启动;

所述sgRNA包含碱基序列如SEQ ID NO:05所示的FAD2的靶序列。

5.如权利要求4所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑载体在检测CRISPR/Cas9基因编辑系统脱靶频率上的应用。

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