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专利号: 2019101891434
申请人: 济宁学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种小麦基因TaCPSF30编码序列的克隆,其特征在于,所述小麦基因TaCPSF30编码序列的克隆是按照以下方法获得的:(1)提取小麦总RNA,反转录合成cDNA;

(2)以cDNA为模板,设计特异引物,通过PCR扩增基因TaCPSF30编码区序列,其中,PCR扩增所用引物序列如下:TaCPSF30正向引物(F):

5’-CGGGGTACCATGGACGACGGCGACGGC-3’;

TaCPSF30反向引物(R):

5’-CCGCTCGAG TCGCTTCCTTGACCGCCT-3’;

(3)回收并纯化(2)的扩增产物中目的片段并进行测序,测序正确的即为小麦基因TaCPSF30编码序列的克隆。

2.根据权利要求1所述的小麦基因TaCPSF30编码序列的克隆的应用,其特征在于,小麦基因TaCPSF30编码序列的克隆在研究植物提高氮素利用率机制和遗传改良中的应用。

3.根据权利要求2所述的小麦基因TaCPSF30编码序列的克隆的应用,其特征在于,先构建出Gateway系统兼容的重组植物表达载体,该表达载体上有35S启动子驱动的TaCPSF30编码序列的克隆和GFP基因,然后将所述重组表达载体转化入拟南芥cpsf30突变体,筛选得到纯合的转基因异源互补株系,研究互补株系中小麦基因TaCPSF30在提高氮素利用率机制和在遗传改良中的应用。

4.根据权利要求3所述的小麦基因TaCPSF30编码序列的克隆的应用,其特征在于,具体步骤如下:S1,pENTR3C-TaCPSF30重组质粒的构建:

酶切连接所述小麦基因TaCPSF30编码序列的克隆与克隆载体pENTR3C:对纯化的小麦基因TaCPSF30编码序列的克隆在分别在5’端和3’端加如KpnI和XhoI酶切位点,双酶切后得到带有黏性末端的目的基因片段;然后与克隆载体pENTR3C进行酶切连接,得到重组质粒pENTR3C-TaCPSF30;

S2,利用Gateway技术构建重组植物表达载体pMDC83-TaCPSF30:将测序正确的重组质粒pENTR3C-TaCPSF30与Gateway系统兼容的植物表达载体pMDC83进行LR反应,得到重组植物表达载体pMDC83-TaCPSF30;

S3,农杆菌侵染拟南芥:

种植拟南芥cpsf30突变体;制备农杆菌感受态细胞;然后用重组表达载体pMDC83-TaCPSF30转化农杆菌感受态细胞;挑取阳性克隆的转化农杆菌侵染拟南芥cpsf30突变体;

得到能有效克隆小麦基因TaCPSF30编码序列的转基因植物体。

5.根据权利要求4所述的小麦基因TaCPSF30编码序列的克隆的应用,其特征在于,所述农杆菌为农杆菌GV3101。

6.根据权利要求4所述的小麦基因TaCPSF30编码序列的克隆的应用,其特征在于,所述植物体为拟南芥cpsf30突变体或者小麦品种中国春。

7.根据权利要求4所述的小麦基因TaCPSF30编码序列的克隆的应用,其特征在于,S3中挑取阳性克隆的转化农杆菌侵染拟南芥cpsf30突变体后,经过3代自交,筛选出含有小麦基因TaCPSF30编码序列的异源互补株系,用于研究小麦基因TaCPSF30编码序列在研究植物提高氮素利用率机制和遗传改良中的应用。