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专利号: 201910207861X
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-08-24
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.假单胞菌JY-Q果糖代谢缺失株的构建方法,其特征在于:以JY-Q/5Δ为原始菌株,包括下述步骤:

1)通过该菌全基因组信息分析,确定以下表达果糖磷酸转移酶的同工酶目的基因:PTS2 AA098_23490;

2)构建目的基因的敲除载体:设计含敲除质粒部分片段的引物,在目的基因上游同源臂的正向引物5’端加入EcoR Ⅰ酶切位点,在目的基因下游同源臂的反向引物5’端加入BamH Ⅰ酶切位点,以融合PCR扩增出目的基因的上下游同源臂后,利用一步克隆法技术在体外将其与酶切后的线性载体pK18mobSacB重组;

3)利用热转法将敲除载体转化到大肠杆菌缺失菌株WM3064中,以此为供体菌,假单胞菌JY-Q/5Δ为受体菌进行双亲本接合;利用载体上的Kanamycin抗性基因,筛选出第一次交换的重组子;

4)将步骤3)所得的菌株过夜扩培后,利用载体上携带的反筛选标记SacB基因,在反筛选平板上,将发生第二次交换的重组子,即目的基因随整合入基因组的质粒载体脱落,从而实现基因无缝敲除;

通过以上步骤,可得到选择性降解的假单胞菌JY-Q果糖代谢缺失株。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的步骤2)中:PTS2引物为:上游同源臂的上游引物A1:ctatgacatgattacgaattcTATTGGGCTTGACCAACCAGG;下游引物A2:GGAACTGCAAAAGGAGAAGGTCATGAAATGGCCAAGATCCTCACTC;下游同源臂的上游引物B1:GAGTGAGGATCTTGGCCATTTCATGACCTTCTCCTTTTGCAGTTCC;下游同源臂的下游引物B2:caggtcgactctagaggatccGAACAGCGCATCGCATCG;其中合成的上游同源臂为563bp,下游同源臂为651bp,融合后上下游同源臂为1214bp。

3.如权利要求1或2所述的方法所得到的假单胞菌JY-Q果糖代谢缺失株应用于废烟叶水提液尼古丁的降解中。