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专利号: 2019102190126
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:

具体步骤为:将雌激素干扰物注入上述固相萃取亲和柱中,依次用超纯水、洗脱剂洗涤固相萃取亲和柱,收集洗脱液;利用高效液相色谱对得到的洗脱液进行检测;所述洗脱剂为甲醇的水溶液,甲醇的质量分数为35~45%;

固相萃取亲和柱的制备方法步骤为:硅胶的酸化预处理,预处理后的硅胶与磺酰氯反应得到氯化硅胶,氯化硅胶与己二酸得到羧基化硅胶,羧基化硅胶与雌激素受体结合元件结合,雌激素受体结合元件与雌激素受体结合后装填入固相萃取空柱管中得到固相萃取亲和柱;

所述雌激素受体结合元件为一种与雌激素受体结合的DNA分子;

DNA分子的序列为:5’‑GTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAAGTTAATG‑3’;

固相萃取亲和柱的制备方法的具体步骤为:

1)硅胶与盐酸混合后进行加热回流,过滤,洗涤,烘干得到预处理后的硅胶;

2)预处理后的硅胶溶于无水吡啶中,加入磺酰氯混合,将得到的产物进行洗涤、烘干得到氯化硅胶;

3)将步骤2)得到的氯化硅胶与己二酸、甲苯、吡啶混合后加热反应,将得到的产物过滤、洗涤得到羧基化硅胶;

4)将羧基化硅胶活化后与雌激素受体结合元件混合反应,将产物用超纯水、封闭剂A洗涤得到羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件;

5)羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件与雌激素受体混合孵育,将产物用超纯水、封闭剂B洗涤、超纯水洗涤,洗涤后将得到的产品装入固相萃取空柱管中得到固相萃取亲和柱。

2.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤1)中盐酸质量百分数为8~12%。

3.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:1g硅胶对应的盐酸的体积为8~15mL。

4.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:回流的温度为100~110℃。

5.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:回流的时间为6~10h。

6.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:烘干的温度为100~120℃,烘干的时间为22~26h。

7.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤2)中1g硅胶对应的无水吡啶、磺酰氯的体积为5~7mL、1.5~2.5mL。

8.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤2)中产物进行洗涤的洗涤剂依次为甲苯和无水硫酸钠的混合物、甲醇、丙酮。

9.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤2)中烘干的温度为100~120℃,烘干的时间为22~26h。

10.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤3)中氯化硅胶与己二酸、甲苯、吡啶的质量比为1:1:5:6。

11.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤3)中加热反应的温度为100~120℃,加热反应的时间为10~14h。

12.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤4)中将羧基化硅胶活化的活化剂为EDC/NHS。

13.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤4)中活化的时间为1.5~2.5h。

14.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:1mg羧基化硅胶对应的雌激素受体结合元件的质量为6~7μg。

15.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤4)中孵育的时间为1.5~2.5h。

16.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤4)中封闭剂A为牛肉血清蛋白或卵清蛋白中。

17.根据权利要求16所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:牛肉血清蛋白的质量百分比为2~4%。

18.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:1mg羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件对应封闭剂A的体积为28~32μL。

19.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:偶联有雌激素受体结合元件的硅胶与封闭剂A反应的时间为1.5~2.5h。

20.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤5)中雌激素受体的浓度为4~6mg/mL。

21.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤5)中孵育的时间为0.5~4h。

22.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤5)中羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件与雌激素受体的质量比为40:1~2。

23.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:步骤5)中封闭剂B为三苯甲胺。

24.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:封闭剂B的浓度为0.02~0.1mg/mL。

25.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:1mg羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件的质量对应的封闭剂B的体积为28~32μL。

26.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:所述雌激素干扰物为雌二醇、双酚A或己烯雌酚。

27.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:所述雌激素干扰物为农兽药残留中的具有雌激素特性的小分子物质。

28.根据权利要求1所述的利用固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法,其特征在于:所述高效液相色谱的检测条件为流动相为40~50%乙腈,柱温为25~35℃,流动相流速为0.7~1.3mL/min,进样体积为18~22μL。