1.一种辣木叶肉原生质体制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取辣木幼苗从茎尖往下数第一分支与第二分支叶片,在超净工作台中去除叶片两端1.5-2mm部分,留中间部分叶片切成0.3-0.4mm条状细丝,并马上将切下的细丝放置在渗透剂中,暗条件下放置;
(2)在室温下,用镊子将全部叶片细丝转移到酶解液中,真空抽滤45-50min,然后置于水平摇床上避光酶解5-5.5h,往酶解产物中加入预冷的W5溶液,混匀,然后经细胞筛过滤至圆底无菌离心管,冰上静置,待溶液出现明显分层,吸去上清,得到辣木叶肉原生质体。
2.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法,其特征在于,步骤(1)的渗透剂为0.5mol/L甘露醇水溶液,所述的渗透剂用量为15mL/25片叶子。
3.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法,其特征在于,步骤(2)的酶解液含有15mg/mL纤维素酶R-10、3mg/mL果胶酶R-10、0.4M的甘露醇、20mM的氯化钾,20mM pH5.7的MES、10mM无水氯化钙、1mg/mL BSA、5mMβ-巯基乙醇,溶剂为超纯水。
4.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法,其特征在于,步骤(2)的在水平摇床上避光酶解是将含有叶片细丝的酶解液置于10cm的无菌培养皿,包上锡箔纸、30rpm避光酶解。
5.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法,其特征在于,步骤(2)的W5溶液含有5mM葡萄糖、154mM氯化钠、125mM氯化钙、5mM氯化钾、2mM pH5.7MES,溶剂为超纯水。
6.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法,其特征在于,步骤(2)的细胞筛孔径大小为40μm。
7.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法,其特征在于,步骤(2)的细胞筛在过滤前用4-5mL的预冷W5溶液过滤,起到湿润细胞筛的作用。
8.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法,其特征在于,步骤(2)的过滤是在冰上进行,将圆底无菌离心管的8/10-9/10管身埋在冰中。
9.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法,其特征在于,所述的辣木幼苗通过以下方法获得:(1)干辣木种子采用蒸馏水浸泡过夜,然后采用1g/L的多菌灵水溶液消毒处理35-
45min,消毒过程中每隔5min充分摇晃;
(2)将消毒后的辣木种子用无菌水洗五遍,铺在湿润育苗纸催芽,一周后挑选生根发芽的幼苗移栽到泥炭土:蛭石=4:1m/m的基质中培养21-25天,得到辣木幼苗,其中催芽和育苗的培养条件均为32℃,光照16h,黑暗8h,光照强度为8000Lux。
10.一种按照权利要求1-9任一所述的辣木叶肉原生质体制备方法制备得到的辣木叶肉原生质体。