1.一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法,其特征在于,包括:
步骤1:以卷曲乳杆菌的DNA为模板,制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌,所述阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
步骤2:将所述重组大肠杆菌经IPTG诱导发酵,去除菌体,制备得到阿魏酸酯酶。
2.根据权利要求1所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法,其特征在于,所述步骤1中,制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌的步骤包括:(1)以卷曲乳杆菌的DNA为模板,PCR扩增阿魏酸酯酶基因片段,PCR扩增所使用的上下游引物分别为:上游引物FaeLcr-F 5′-atacatatgtcccgcgttacaattg-3′下游引物FaeLcr-R 5′-gcgctcgagaaataatggttttaaaaattg-3′;
(2)将所得阿魏酸酯酶基因片段经NdeI和XhoI双酶切,与相同酶切线性化的表达载体pET-22b(+)连接,构建得到重组表达载体pET-FaeLcr;将重组表达载体pET-FaeLcr转化至宿主菌种大肠杆菌中,得到重组大肠杆菌。
3.根据权利要求2所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,卷曲乳杆菌的DNA获得方法为:取过夜活化的卷曲乳杆菌菌液1ml,6000rpm,4℃离心
3min收集菌体,重悬于567μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0),添加25μL
50mg/ml溶菌酶,混匀,37℃水浴处理1h;加入30μL 10%(质量百分比)SDS、3μL 20mg/ml的蛋白酶K,65℃条件下水浴1h,再加入预冷的氯仿3mL,混匀后离心收集上清;加入等体积预冷的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)溶液,颠倒混匀后离心,取上层水相加入等体积的24:1(氯仿:异戊醇),再次离心,取上层水相加入0.6倍体积的预冷异丙醇,室温水浴醇沉1h,离心收集沉淀;最后用70%乙醇清洗沉淀2次,吹干,取40μL TE缓冲液溶解沉淀,即得卷曲乳杆菌DNA。
4.根据权利要求2所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,PCR扩增条件:2×Taq Master Mix 25μL,上下游引物(10μM)各2μL,DNA模板1μL,add ddH2O至50μL;
PCR反应条件:95℃预变性5min;95℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸45s,30个循环,
72℃延伸10min,4℃保存。
5.根据权利要求2所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中,酶切条件为37℃,3h,酶切体系为:NdeI 5 μL,XhoI 5μL,10×K Buffer 10μL,0.1%BSA
10μL,阿魏酸酯酶DNA/pET-22b(+)质粒DNA 5μg,无菌水补足至100μL;将经过双酶切的阿魏酸酯酶DNA片段和pET-22b(+)载体DNA按照10:1的摩尔比例混合,加入T4 DNA连接酶,16℃过夜连接;将10μL连接产物加入100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,冰上孵育30min,42℃水浴热激60s,后加入900μL LB液体培养基37℃孵育1h;150rpm将菌液离心去掉上清液
800μL,用剩余的菌液重悬菌体,涂布于加有100μg/mL氨苄霉素的LB平板;转化,得到重组大肠杆菌。
6.根据权利要求1所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法,其特征在于,所述步骤2中,将重组大肠杆菌接种至LB液体培养基,37℃过夜培养,取菌液,以1%-2%接种量加入到
100mL的LB液体培养基中,37℃培养,生长至菌液OD为0.5-0.8时,加入终浓度0.1-1mM的IPTG,继续诱导发酵16-24h;将诱导表达的大肠杆菌培养液,13000rpm离心10min,去除菌体,收集上清液用0.22μm滤膜过滤后,即得阿魏酸酯酶。
7.权利要求1-6任一所述的阿魏酸酯酶在制备阿魏酸中的应用,其特征在于,所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.根据权利要求7所述的阿魏酸酯酶在制备阿魏酸中的应用,其特征在于,所述制备阿魏酸的条件为温度55~65℃、pH6.5~9。
9.根据权利要求8所述的阿魏酸酯酶在制备阿魏酸中的应用,其特征在于,所述制备阿魏酸的条件为温度56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或以上任意两个数值之间的范围;所述制备阿魏酸的条件为pH7.0、7.5、8.0、8.5或以上任意两个数值之间的范围。
10.根据权利要求7所述的阿魏酸酯酶在制备阿魏酸中的应用,其特征在于,所述制备阿魏酸的原料为去淀粉麦麸;所述阿魏酸作为抗氧化剂,应用于食品、制药、化妆品、造纸或饲料领域。