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专利号: 2019104395135
申请人: 南宁师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-11-19
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用于检测二价汞离子的生物工程菌,其特征在于,所述工程菌中含有表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900,其中,merR mer-phzM-mer-phzS为重组基因,pAK1900为质粒骨架。

2.如权利要求1所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)利用PCR技术分别扩增基因片段merR mer、phzM和phzS,将扩增后的基因片段merR mer和基因片段phzM通过重叠延伸PCR技术拼接,并将拼接产物通过PCR技术扩增,得到基因片段merR mer-phzM;

2)使用限制性内切酶HindIII和BamHI对载体质粒pAK1900和基因片段merR mer-phzM进行双酶切,使基因片段merR mer-phzM和载体质粒pAK1900同时露出相同的粘性末端,通过T4 DNA连接酶将基因片段merR mer-phzM和载体质粒pAK1900连接,构建质粒merR mer-phzM-pAK1900;

3)利用PCR技术扩增质粒merR mer-phzM-pAK1900中的基因片段mer,将扩增的基因片段mer和基因片段phzS通过重叠PCR技术实现连接,获得基因片段mer-phzS;

4)使用限制性内切酶BamHI对质粒merR mer-phzM-pAK1900和基因片段mer-phzS进行单酶切,再用T4 DNA连接酶将质粒merR mer-phzM-pAK1900与基因片段mer-phzS连接,构建表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900;

5)将表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900转化至感受态细胞,扩增并提取表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900,转化至绿脓杆菌,获得所述生物工程菌。

3.如权利要求2所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,步骤5)中,所述感受态细胞为E.coli DH5α。

4.如权利要求2所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,所述基因片段merR mer-phzM的构建方法为:分别以全基因合成的基因片段merR mer和基因片段phzM为模板,进行第一次PCR扩增反应以分别扩增基因片段merR mer和基因片段phzM,将扩增的基因片段merR mer和基因片段phzM通过重叠延伸PCR技术连接,获得连接片段merR mer-phzM,以连接片段merR mer-phzM为模板,通过PCR技术扩增,获得基因片段merR mer-phzM。

5.如权利要求4所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,第一次PCR扩增反应包含35个循环,其中,一次循环依次包括98℃变性10s,55℃退火10s,72℃延伸10-90s,引物为primer I和primer II。

6.如权利要求2所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,基因片段mer-phzS的构建方法为:以质粒merR mer-phzM-pAK1900为模板进行第二次PCR扩增反应以扩增基因片段mer;以全基因合成的基因片段phzS为模板进行第三次PCR扩增反应以扩增基因片段phzS。

7.如权利要求6所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,第二次PCR扩增反应包含30个循环,其中,98℃变性10s,55℃退火10s,72℃延伸1min,引物为primer V和primer VI;第三次PCR扩增反应包含30个循环,其中,98℃变性10s,55℃退火

10s,72℃延伸1min,引物为primer VII和primer VIII。

8.如权利要求1所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的用途,其特征在于,所述生物工程菌用于检测水环境中是否含有二价汞离子。