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专利号: 201910516667X
申请人: 延安大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-02-23
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体在制备抗非洲猪瘟病疫苗中的应用,其特征在于,所述非洲猪瘟病毒串联基因为P32‑CD2V‑I329L‑G6L,其中CD2V截取自CD2V基因的抗原肽片段,I329L截取自I329L基因的抗原肽片段;P32基因、CD2V基因、G6L基因均来自FN557520.1毒株,I329L基因来自FR682468.1毒株;

所述共表达载体是由多基因克隆表达元件连入pIRES2‑egfp载体中的BglII和BamHI酶切位点之间,并且在pIRES2‑egfp载体1986nt的XbaI位点之后插入oriR101基因获得,所述基因克隆表达元件的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示;

所述疫苗通过以下方法制备得到的:将含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体转化进大肠杆菌感受态细胞中,筛选并扩大培养后收集纯化多基因蛋白,得抗非洲猪瘟病亚单位疫苗。

2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体的构建方法包括如下步骤:S1,分别对CD2V蛋白的基因序列、I329L蛋白的基因序列进行抗原肽片段的截取,分别获得CD2V基因和I329L基因;

S2,通过DNA重组技术,利用连接肽Linker1、Linker2和Linker3按照P32、Linker1、CD2V、Linker2、I329L、Linker3、G6L的顺序连接,得到基因片段P32‑Linker1‑CD2V‑Linker2‑I329L‑Linker3‑G6L;

其中,Linker1的氨基酸序列为:GGGGGGPPPPPP;Linker2的氨基酸序列为:PPPPPPGGGGGG;Linker3氨基酸序列为:PPPGGGPPPGGG;

S3,通过DNA重组技术将IRES1、IRES2、IRES3核苷酸序列依次插入基因片段P32‑Linker1‑CD2V‑Linker2‑I329L‑Linker3‑G6L之间;得到基因片段P32‑Linker1‑IRES1‑CD2V‑Linker2‑IRES2‑I329L‑Linker3‑IRES3‑G6L;

获得IRES1、IRES2、IRES3的引物序列如下:

IRES1F:GATGATATCTGACCCCTCTCCCTCCCCCC;

IRES1R:AACTGCAGATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAA;

IRES2F:ACGCGTCGACTGACCCCTCTCCCTCCCCCC;

IRES2R:AGAGAGCTCATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAA;

IRES3F:AAAAGTACTTGACCCCTCTCCCTCCCCCC;

IRES3R:CCGCTCGAGATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAA;

S4,在P32前后分别添加EcoRI、EcoRV酶切位点,CD2V前后分别添加PstI、SalI酶切位点,I329L前后分别添加SacI、ScaI酶切位点,G6L前添加XhoI酶切位点,得到基因片段EcoRI‑P32‑EcoRV‑Linker1‑IRES1‑PstI‑CD2V‑SalI Linker2‑IRES2‑ScaI‑I329L‑ScaI‑Linker3‑IRES3‑XhoI‑G6L;

S5,在P32、CD2V、I329L、G6L目的基因后面均添加His‑tag,序列:CACCACCACCACCACCAC;

得到基因片段EcoRI‑P32‑(His‑tag)‑EcoRV‑Linker1‑IRES1‑PstI‑CD2V‑(His‑tag)‑SalI Linker2‑IRES2‑ScaI‑I329L‑(His‑tag)‑ScaI‑Linker3‑IRES3‑XhoI‑G6L‑(His‑tag);

S6,将S5获得的基因片段连接在pET‑32a载体的启动子及部分序列之后,得到多基因克隆表达元件,所述pET‑32a载体的启动子及部分序列为:TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAC AAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATG;

S7,将多基因克隆表达元件连入pIRES2‑egfp载体中的BglII和BamHI酶切位点之间,并且在pIRES2‑egfp载体1986nt的XbaI位点之后插入oriR101基因,得到非洲猪瘟病多基因共表达载体。