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专利号: 2019107525022
申请人: 盐城工学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-02-23
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体,其特征在于,所述卤醇脱卤酶突变体在SEQ ID NO. 1所示序列中R位进行单点突变,所述R位为R1位、R2位、R4位中的至少一种,所述R1位为第89位精氨酸,R2位为第137位缬氨酸、R4位为第179位天冬酰胺,当R为R1时,将第

89位精氨酸分别突变为酪氨酸和赖氨酸,得到突变体R89Y、R89K;

当R为R2时,将第137位缬氨酸突变为异亮氨酸,得到突变体V137I;

当R为R4时,将第179位天冬酰胺分别突变为谷氨酰胺和亮氨酸,得到突变体N179Q和N179L;

当R为R1和R2或R4时,将第89位精氨酸突变为酪氨酸且第137位缬氨酸突变为异亮氨酸或将第89位精氨酸突变为酪氨酸且将第179位天冬酰胺突变为亮氨酸,分别得到突变体R89Y‑V137I和R89Y‑N179L;

当R为R2和R4时,将第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且第179位天冬酰胺突变为谷氨酰胺,得到突变体V137I‑N179Q;

当R为R1、R2和R4时,将第89位精氨酸分别突变为酪氨酸、第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且将第179位天冬酰胺分别突变为亮氨酸,得到突变体R89Y‑V137I‑N179L。

2.一种编码如权利要求1所述的提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体的基因。

3.一种携带如权利要求2所述基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒,其特征在于,所述重组质粒的表达载体是pET28a(+),所述重组质粒的表达宿主是E.coliBL21(DE3)。

5.一种表达如权利要求2所述基因的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌的制备步骤为:以携带编码权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体的基因的重组质粒为模板,设计合成引物,并通过PCR定点饱和突变或组合突变制备携带编码权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体的基因的重组质粒,进行转化表达宿主。

7.权利要求1所述的提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体、权利要求3所述的重组质粒或权利要求5所述的基因工程菌在制备催化拆分环氧化物开环合成手性环氧化物和手性β‑取代醇的催化剂中的应用,所述手性环氧化物为(S)‑邻硝基苯基缩水甘油醚、(R)‑苄基缩水甘油醚、(R)‑苯基缩水甘油醚,所述手性β‑取代醇为(R)‑1‑叠氮‑3‑(2‑硝基苯氧基)‑2‑丙醇。

8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述环氧化物为苯基缩水甘油醚、苄基缩水甘油醚和邻硝基苯基缩水甘油醚。

9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,权利要求5所述基因工程菌制备催化拆分环氧化物开环合成手性环氧化物和手性β‑取代醇催化剂的方法如下:将含有卤醇脱卤酶基因的重组工程菌接种于含有质量浓度为50 mg/L卡那霉素的50 mL LB液体培养基于37 ℃,

200 r/min条件下培养10 h;然后以1 vt.%的接种量接种到新的含终质量浓度为50 mg/L的卡那霉素的50 mL LB培养基中,仍以37 ℃,200 r/min培养,待培养至光学密度OD600为0.6‑

0.8时,加入异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷诱导剂,至终浓度为0.15 mM,在28 ℃,200 r/min下诱导表达12 h;5000×g,5 min离心收集菌体,并以pH 8.0的NaH2PO4‑Na2HPO4缓冲液重悬清洗菌体,5000×g离心5 min,收集E. coli菌体,于‑20 ℃储存备用。