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专利号: 2019108070927
申请人: 青岛科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-02-23
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测系统,其特征在于,所述肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测系统包括:3D DNA Walker纳米复合探针由金纳米粒子核、Cy5修饰的发夹DNA H1以及摆臂Walker‑Blocker组成,其中Cy5修饰的发夹DNA H1以及摆臂Walker‑Blocker负载在金纳米粒子核上;DNA四面体复合物的顶点连接Rox修饰的发夹DNA H2;miRNA‑21作为3D DNA Walker的激活剂;

使用所述检测系统的肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测方法包括:miRNA‑21作为3D DNA Walker的激活剂;3D DNA Walker触发后,DNA Walker、DNA H1、DNA H2的催化发夹反应进行信号放大,实现对miRNA‑21的比率型、荧光拉曼双模式检测;金纳米粒子和DNA四面体结构可以进入肿瘤细胞内,实现对肿瘤细胞的比率型、荧光拉曼双模式成像;

其中miRNA‑21的序列为:SEQ ID NO:1,miRNA‑21:uagcuuaucagacugauguuga其中Blocker的序列为:SEQ ID NO:2,Blocker:ttttcgatcaacatcagtctgataagcta其中Walker的序列为:SEQ ID NO:3,Walker:SH‑ttttcacaattacatcctcattaacttacacttgattttttttttcagacatggcgacgtctactgatgttg

atcgaaaa

其中DNA H1的序列为:SEQ ID NO:4,H1:SH‑acatcagtagacgtcgccatgtctgatgctagccagcgtct‑Cy5其中DNA H2的DNA序列为:SEQ ID NO:5,H2:cgagctaagccgtgtagacgctggctagcatcagacatggcgacgtctactgatgc‑Rox其中制备DNA四面体复合物的四条链的序列为:SEQ ID NO:6,

THa:acacggcttagcgcttatcaccaggcagttgacagtgtagcaagctgtaatagatgcgagggtccaatac

SEQ ID NO:7,

THb:acacggcttagcgcttcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggctcttc

SEQ ID NO:8,

THc:acacggcttagcgcttttcagacttaggaatgtgcttcccacgtagtgtcgtttgtattggaccctcgcat

SEQ ID NO:9,

THd:acacggcttagcgctacattcctaagtctgaaacattacagcttgctacacgagaagagccgccatagta。

2.如权利要求1所述的肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测系统,其特征在于,所述肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测方法包括以下步骤:第一步,制备3D DNA Walker纳米复合探针;

第二步,制备DNA四面体复合物;

第三步,将第一步和第二步的产物与miRNA‑21反应,进行体外双模式检测;

第四步,将第一步和第二步的产物与肿瘤细胞孵育,进行细胞的双模式成像。

3.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测系统,其特征在于,所述3D DNA Walker纳米复合探针的合成方法包括:20nm金纳米粒子的合成参考现有的制备方法,于棕色瓶中4℃保存;20μL 10nM的DNA Walker与20μL 10nM DNA Blocker在95℃水浴5min再自然冷却至室温以合成Walker‑Blocker;20μL 10nM的发夹DNAH1在90℃的水浴中孵育5min自然冷却至室温,冷却后的DNA H1与20μL 1nM的Walker‑Blocker分别加入TCEP活化;随后加入1mL 20nm的金纳米粒子与20μL醋酸钠缓冲溶液;室温下摇晃过夜,反应完成后离心13000r/min,4℃,15min,洗涤三次,分散到80μL 0.1%的PBS缓冲液中。

4.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测系统,其特征在于,所述DNA四面体复合物的制备方法包括:DNA四面体的THa‑d四条链分散在TM缓冲溶液中至终浓度为50nM,每条链取2μL加入92μL TM缓冲溶液混合均匀;于95℃水浴加热2min,置于4℃1min,合成的DNA四面体的终浓度为1nM;将DNA四面体与退火后的发夹DNA H2等量混合在

37℃的水浴中孵育2h。

5.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测系统,其特征在于,所述miRNA‑21的细胞外检测方法包括:10μL分散后的纳米复合探针加入10μL不同浓度的miRNA‑21在室温下反应2h,再加入10μL1 nM DNA四面体复合物反应2h;反应后的复合物离心分散到5μL PBS缓冲液中进行细胞外拉曼和荧光检测。

6.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测系统,其特征在于,所述miRNA‑21的细胞内荧光检测方法包括:癌细胞在胰蛋白酶消化后接种在96孔玻璃底培养板中,当细胞生长至孔板面积的50%时,加入20μL纳米复合探针和20μL 1μM发夹DNA H2反应;使用Leica TCS SP5倒置共聚焦显微镜进行荧光成像;所用荧光基团Cy5和Rox的激发光源为633nm和514nm,并且分别使用640‑700nm通道和540‑640nm通道捕获不同的荧光信号进行成像。

7.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测系统,其特征在于,所述miRNA‑21的细胞内拉曼检测方法包括:癌细胞在胰蛋白酶消化后接种在金玻璃片上过夜,加入20μL纳米复合探针和20μL 1μM发夹DNA H2,进行不同时间的孵育;将细胞培养皿固定到显微镜载物台上,在细胞培养的状态下进行SERS成像;使用拉曼光谱仪的633nm激光器,并用50倍物镜进行SERS细胞成像。

8.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测系统,其特征在于,所述肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测方法的拉曼检测数据的处理包括:选取‑1 ‑1

1600cm 为Cy5的拉曼特征吸收峰,1640cm 为Rox的拉曼特征吸收峰,分别对其出峰位置的出峰强度进行扣除空白处理,并且使用I1640/I1600为最终的线性分析对象进行线性分析。

9.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测系统,其特征在于,所述肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测方法的荧光检测数据的处理:使用648nm的激发波长对Cy5测定荧光光谱,最大发射波长为688nm;使用550nm的激发波长对Rox测定荧光光谱,最大发射波长为610nm,分别对其出峰强度进行扣除空白处理,并且使用F610/F688为最终的线性分析对象进行线性分析。