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专利号: 2019110222608
申请人: 电子科技大学中山学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一组提取腐乳微生物DNA的试剂,其特征在于包括细胞分离液、细胞冲洗液、细胞裂解液、PCR抑制物质沉淀液和清洗液;

所述的细胞分离液含有10~20mM磷酸二氢钾,10~20mM磷酸氢二钠,100~200mM氯化钠,1~2mM氯化钾,pH值7~8;

所述的细胞冲洗液含有100~200mM磷酸二氢钾,100~200mM磷酸氢二钠,0.05~

0.10%吐温20,pH值7~8;

所述的细胞裂解液含有0.5~1.0%SDS,0.5~1.0%聚乙二醇辛基苯基醚,100~200mM Tris-HCl,0.5~1.0mM EDTA,50~100mM KCl,pH值7~8;

所述的PCR抑制物质沉淀液含有100~200mM磷酸二氢钾,100~200mM磷酸氢二钠,50~

100mM硫酸铵,200~500mM盐酸胍,1~2%CTAB,pH值7~8;

所述的清洗液含有75~85%乙醇,100~200mM NaCl,10~20mM Tris,pH值7~8。

2.一种提取腐乳微生物群落DNA的方法,其特征在于采用权利要求1所述的试剂进行提取,步骤如下:(1)将腐乳样品捣碎,加入碳化钨珠和细胞分离液,震荡充分混合,然后静置几分钟,离心,收集沉淀;

(2)向步骤(1)的沉淀中加入细胞冲洗液,震荡充分混合,然后静置几分钟,离心,收集沉淀;

(3)向步骤(2)的沉淀中加入细胞裂解液,再加入直径分别为0.7mm和0.15mm的石榴石,震荡充分混合;然后加入溶菌酶反应液,37℃水浴1~2小时,再加入蛋白酶K和20%SDS,37℃摇床震荡0.5~1小时,后放入65℃水浴中,每隔10分钟拿出震荡一次,持续1.0~1.5小时;

(4)步骤(3)最终获得的溶液,震荡充分混合,然后冷冻离心,吸取上清液转入新的离心管中;往上清液中加入PCR抑制物质沉淀液,混匀,37℃温浴5~10分钟后,离心,转移上清液到新离心管中;

(5)向上清液中加入苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液,混匀后做冷冻离心,吸取上清转移到新离心管中;加入无水乙醇,混匀后吸取到硅胶膜离心柱,离心,丢弃过滤液;

(6)向硅胶膜离心柱中加入清洗液,离心,丢弃过滤液,重复此过程2~3次;然后将硅胶膜离心柱离心,最后加入65℃预热的无核酸酶灭菌水,室温孵育离心柱滤膜几分钟,离心,收集DNA。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(3)中,每g沉淀加入0.5~1.0g直径

0.7mm以及1~2g直径0.15mm的石榴石。

4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(3)中,按每10ml细胞裂解液加入1~

2ml浓度为20mg/m L的蛋白酶K和1~2ml 20%SDS。

5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(1)所述的碳化钨珠的直径为10~

30mm。

6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(1)、(2)、(4)、(5)和(6)所述的离心是(12000~13000)×g离心1~5分钟。

7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(4)和(5)所述的冷冻离心是4~6℃下、(12000~13000)×g离心15~20分钟。

8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(4)所述的PCR抑制物质沉淀液与上清液的体积比为1:1。

9.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(5)所述的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液中,苯酚、氯仿、异戊醇三者的体积比为25:24:1;所述的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液与上清液的体积比为1:1。

10.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(5)所述无水乙醇与上清液的体积比为1:1。