1.一种利用大肠杆菌工程菌制备α，β不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，步骤如下：发酵培养大肠杆菌工程菌，诱导表达后收集菌体，超声破碎菌体细胞，向破碎菌液中加入癸酸，35～40℃条件下利用无细胞体系生产反式‑2‑癸烯酸；

所述大肠杆菌工程菌的构建方法，步骤如下：(1)构建重组质粒petDuet‑FadE、重组质粒pet28a‑sumo‑YdiI；

所述酯酰辅酶脱氢酶FadE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；酯酰CoA硫酯酶基因Y diI的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

（2）利用步骤（1）制得的重组质粒petDuet‑FadE,构建petDuet‑FadE‑FadD质粒；

脂酰CoA合成酶基因FadD的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

（3）利用RED重组法敲除FadR和FadB基因，构建基因缺失菌株∆FadRB；

（4）取步骤（1）、（2）制得的重组质粒pet28a‑sumo‑YdiI和petDuet‑FadE‑FadD质粒共转化到基因缺失菌株∆FadRB，制得重组菌YED‑∆FadRB。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，构建重组质粒petDuet‑FadE，包括如下步骤：

以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增酯酰辅酶脱氢酶FadE基因,上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，然后将petDuet质粒用HindIII进行酶切、纯化，再与酯酰辅酶脱氢酶FadE的基因进行无缝克隆，制得重组质粒petDuet‑FadE；

PCR扩增体系如下，总体系50μL：

100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μL phanta酶25μL，ddH2O 

19μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min15s，循环30次；72℃延伸

5min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，构建重组质粒pet28a‑sumo‑YdiI，包括如下步骤：

以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增酯酰CoA硫酯酶基因Y diI, 上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，然后将pet28a‑sumo质粒和酯酰CoA硫酯酶基因Y diI分别用BamH I和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pet28a‑sumo‑YdiI；

PCR扩增体系如下，总体系50μL：

100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μL phanta酶25μL，ddH2O 

19μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min15s，循环30次；72℃延伸

5min。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述连接酶连接条件为22℃连接10min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，构建petDuet‑FadE‑FadD质粒的具体步骤如下：

以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增脂酰CoA合成酶基因FadD,上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，将步骤（1）制得的重组质粒petDuet‑FadE，用Xho1进行酶切、纯化，再与脂酰CoA合成酶基因FadD进行无缝克隆，制得重组质粒petDuet‑FadE‑FadD；

PCR扩增体系如下，总体系50μL：

100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μL phanta酶25μL，ddH2O 

19μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min15s，循环30次；72℃延伸

5min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，构建基因缺失菌株∆FadRB采用RED同源重组法，包括构建FadR敲除框、构建FadB敲除框和分别将FadR敲除框与FadB敲除框转化入pkd46‑BL21。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述构建FadR敲除框的具体步骤如下：以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增操纵子基因的上游同源臂FadR1，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增烯酰辅酶A水合酶基因的下游同源臂FadR2，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；以pkd3质粒为模板，扩增FRT‑RKan‑FRT基因片段，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；然后将FadR1与FRT‑RKan‑FRT基因片段进行重叠PCR，回收扩增产物，然后与FadR2再进行一次重叠PCR；最终纯化胶回收获得FadR敲除框；

PCR扩增体系如下，总体系50μL：

100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μL phanta酶25μL，ddH2O 

19μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min15s，循环30次；72℃延伸

5min。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述构建FadB敲除框的具体步骤如下：以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增烯酰辅酶A水合酶基因的上游同源臂FadB1, 上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增烯酰辅酶A水合酶基因的下游同源臂FadB2, 上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；以pkd3质粒为模板，扩增FRT‑BKan‑FRT基因片段，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；然后将FadB1与FRT‑BKan‑FRT基因片段进行重叠PCR, 重叠完成后胶回收再与FadB2再一次进行重叠PCR；最终纯化胶回收获得FadB敲除框；

上述PCR扩增体系如下，总体系50μL：

100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μL phanta酶25μL，ddH2O 

19μL；

上述PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min15s，循环30次；72℃延伸

5min。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分别将FadR敲除框与FadB敲除框转化入pkd46‑BL21的具体步骤如下：a、将质粒pkd46转化进BL21感受态中，获得的pkd46‑BL21重组菌，再用CaCl2处理制备pkd46‑BL21感受态；

b、将FadR敲除框Rk转化进pkd46‑BL21感受态中，验证pkd46‑Rk‑BL21重组菌确认敲除框转入后，42℃消除pkd46，筛选后得到Rk‑BL21重组菌；

c、将Rk‑BL21重组菌制备感受态转化pcp20质粒，42℃消除Rk抗性以及pcp20质粒，获得∆FadR重组菌，制为∆FadR感受态备用；

d、将质粒pkd46转化进∆FadR感受态中，获得pkd46‑∆FadR重组菌，再用CaCl2处理制备pkd46‑∆FadR感受态；

e、将FadB敲除框Bk转化进pkd46‑∆FadR感受态中，验证pkd46‑Bk‑BL21重组菌确认敲除框转入后，42℃消除pkd46，筛选后得到Bk‑∆FadR重组菌；

f、将Bk‑∆FadR重组菌制备感受态转化pcp20质粒，42℃消除Bk抗性以及pcp20质粒，获得∆FadRB重组菌。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，构建重组菌YED‑∆FadRB的具体步骤如下：

取步骤（3）中的∆FadRB的菌株用CaCl2处理制备感受态，取步骤（1）、（2）制得的重组质粒pet28a‑sumo‑YdiI和petDuet‑FadE‑FadD质粒共转化到基因缺失∆FadRB感受态中，制得YED‑∆FadRB重组菌株。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导表达为：将活化的重组大肠杆菌接入100mL含有相应抗生素的液体培养基中，35～40℃振荡培养至菌液OD600为0.8～1.2时，加入终浓度为0.5～0.8mM的IPTG、0.5～0.8％的油酸、0.2～

0.5％的吐温80，降温至18～22℃过夜培养。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述诱导表达为：将活化的重组大肠杆菌接入100mL含有卡那霉素和氨苄霉素的液体培养基中，37℃振荡培养至菌液OD600为1.0时，加入终浓度为0.64mM的 IPTG、0.6％的油酸、0.3％的吐温80，降温至18℃过夜培养。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癸酸的反应浓度为4g/L。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癸酸溶解于二甲基亚砜。