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专利号: 2019110522195
申请人: 湖北工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2024-02-23
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及Pilf,其特征在于:所述鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及Pilf的蛋白质序列是:

MFDGNYLDPVEGNSTEVGLKSAWFDGRLNGTLALYHIKQDNLAQEAGQVTRNGVKETYYRAAKGATSEGFEVEVSGQITPDWNITAGYSQFSAKDANDADVNTQLPRKMIQSFTTYKLPGKLENITVGGGVNWQSSTYVNAKNPKKVIEKVEQGDYALVNLMARYQITKDFSAQLNINNVFGGSGGSGGSGGSAVKVRTQLAAEYIRSGDLDSAKRSLDQALSVDSRDATANMMMGILLQQEGSKSNLEKAEHYFKRAISSEPDNAQARNNYGTYLYQMERYNDAIEQFRIAGATLGYDQRYQALENLGRIYLKLGNIASAEKTFKQALLANRDSYISMLELAEIFYLQQ;

用于编码鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及Pilf的蛋白质的基因全序列是:

CATATGTTCGATGGCAACTACCTGGACCCGGTAGAAGGTAACTCTACTGAAGTTGGTCTCAAATCCGCTTGGTTTGACGGCCGTCTGAACGGTACCCTGGCTCTGTACCACATCAAACAGGACAACCTGGCACAGGAAGCGGGCCAAGTTACCCGTAACGGTGTTAAAGAGACTTACTACCGTGCAGCGAAAGGCGCTACATCCGAAGGTTTTGAAGTTGAAGTATCAGGTCAGATCACTCCAGATTGGAACATCACCGCAGGTTACTCTCAATTTTCTGCTAAGGACGCGAACGATGCGGACGTAAACACTCAGCTTCCGCGTAAAATGATCCAGAGCTTCACTACCTATAAACTGCCTGGTAAACTGGAAAACATCACAGTTGGCGGTGGCGTAAACTGGCAGTCTTCTACCTACGTGAACGCAAAAAACCCGAAAAAAGTAATCGAAAAAGTTGAGCAGGGTGACTACGCTCTGGTAAACCTGATGGCGCGTTACCAGATCACTAAGGACTTTTCTGCACAGCTTAACATTAACAACGTTTTCGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGCGGTTAAGGTACGCACTCAACTGGCGGCTGAATATATCCGTTCAGGTGATCTGGACTCCGCGAAACGCTCCCTGGACCAGGCCCTGAGCGTTGACTCTCGTGACGCGACAGCAAACATGATGATGGGCATCCTGCTGCAGCAGGAGGGCTCTAAATCTAACCTGGAGAAAGCGGAGCACTACTTCAAACGTGCTATCAGTTCTGAACCGGATAACGCTCAGGCGCGCAACAACTATGGTACCTATCTGTACCAGATGGAACGTTATAACGACGCGATTGAACAGTTTCGTATCGCAGGTGCGACCCTGGGTTATGATCAGCGTTATCAGGCGCTGGAAAACCTGGGCCGCATCTACCTGAAGCTGGGTAACATCGCCAGCGCTGAAAAAACTTTCAAGCAGGCACTGCTGGCGAACCGTGACTCCTACATCTCTATGCTGGAGCTGGCTGAAATCTTTTACCTGCAGCAGTAAGGATCC。

2.用于制备如权利要求1所述的鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及Pilf的方法,其特征在于:所述方法是:

分别获取鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及表面蛋白Pilf胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列,优化肽段基因编码序列,并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接,形成融合基因;所述鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及表面蛋白Pilf在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为KMV27515及AJF80497;所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs;同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为FhuPil;

所述FhuPil的基因全序列是:

CATATGTTCGATGGCAACTACCTGGACCCGGTAGAAGGTAACTCTACTGAAGTTGGTCTCAAATCCGCTTGGTTTGACGGCCGTCTGAACGGTACCCTGGCTCTGTACCACATCAAACAGGACAACCTGGCACAGGAAGCGGGCCAAGTTACCCGTAACGGTGTTAAAGAGACTTACTACCGTGCAGCGAAAGGCGCTACATCCGAAGGTTTTGAAGTTGAAGTATCAGGTCAGATCACTCCAGATTGGAACATCACCGCAGGTTACTCTCAATTTTCTGCTAAGGACGCGAACGATGCGGACGTAAACACTCAGCTTCCGCGTAAAATGATCCAGAGCTTCACTACCTATAAACTGCCTGGTAAACTGGAAAACATCACAGTTGGCGGTGGCGTAAACTGGCAGTCTTCTACCTACGTGAACGCAAAAAACCCGAAAAAAGTAATCGAAAAAGTTGAGCAGGGTGACTACGCTCTGGTAAACCTGATGGCGCGTTACCAGATCACTAAGGACTTTTCTGCACAGCTTAACATTAACAACGTTTTCGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGCGGTTAAGGTACGCACTCAACTGGCGGCTGAATATATCCGTTCAGGTGATCTGGACTCCGCGAAACGCTCCCTGGACCAGGCCCTGAGCGTTGACTCTCGTGACGCGACAGCAAACATGATGATGGGCATCCTGCTGCAGCAGGAGGGCTCTAAATCTAACCTGGAGAAAGCGGAGCACTACTTCAAACGTGCTATCAGTTCTGAACCGGATAACGCTCAGGCGCGCAACAACTATGGTACCTATCTGTACCAGATGGAACGTTATAACGACGCGATTGAACAGTTTCGTATCGCAGGTGCGACCCTGGGTTATGATCAGCGTTATCAGGCGCTGGAAAACCTGGGCCGCATCTACCTGAAGCTGGGTAACATCGCCAGCGCTGAAAAAACTTTCAAGCAGGCACTGCTGGCGAACCGTGACTCCTACATCTCTATGCTGGAGCTGGCTGAAATCTTTTACCTGCAGCAGTAAGGATCC;

所述FhuPil基因编码的蛋白质序列是:

MFDGNYLDPVEGNSTEVGLKSAWFDGRLNGTLALYHIKQDNLAQEAGQVTRNGVKETYYRAAKGATSEGFEVEVSGQITPDWNITAGYSQFSAKDANDADVNTQLPRKMIQSFTTYKLPGKLENITVGGGVNWQSSTYVNAKNPKKVIEKVEQGDYALVNLMARYQITKDFSAQLNINNVFGGSGGSGGSGGSAVKVRTQLAAEYIRSGDLDSAKRSLDQALSVDSRDATANMMMGILLQQEGSKSNLEKAEHYFKRAISSEPDNAQARNNYGTYLYQMERYNDAIEQFRIAGATLGYDQRYQALENLGRIYLKLGNIASAEKTFKQALLANRDSYISMLELAEIFYLQQ;

所述FhuPil基因编码的蛋白质序列为鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue的509‑688 aa及表面蛋白Pilf的28‑184 aa;两段蛋白序列中间以柔性连接肽ggsggsggsggs进行连接;

将FhuPil的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET‑28a(+),转入E.coli 

2+

BL21(DE3)菌中,用IPTG诱导重组大肠杆菌表达,用Ni 亲和层析法纯化重组FhuPil蛋白。

3.一种用于制备抗鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及Pilf多克隆抗体的方法,其特征在于:所述方法是将如权利要求2所述的重组FhuPil蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔,抽血进行效价测定,分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化,最终获得抗鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及Pilf多克隆抗体。

4.一种鲍曼不动杆菌表面蛋白OmpA及ponA,其特征在于:所述鲍曼不动杆菌表面蛋白OmpA及ponA的蛋白质序列是:

MLGYTFQDTQHNNGGKDGELTNGPELQDDLFVGAALGIELTPWLGFEAEYNQVKGDVDGLAAGAEYKQKQINGNFYVTSDLITKNYDSKIKPYVLLGAGHYKYEIPDLSYHNDEEGTLGNAGVGAFWRLNDALSLRTEARGTYNEAAAAKEAAAAKGSIEAIVGGYNFYQSKFNRALQGWRQPGSTIKPFLYALALERGMTPYSMVNDSPITIGKWTPKNSDGRYLGMIPLRRALYLSRNTVSVRLLQTVGIERTRQLFMDFGLQEDQIPRNYTIALGTPQVLPIQMATGYATFANGGYRVQPHFIQRIEDAYGKVIYEAKPEY;

用于编码鲍曼不动杆菌表面蛋白OmpA及ponA的蛋白质的基因全序列是:

CATATGCTGGGTTACACCTTCCAGGATACTCAGCACAACAACGGCGGTAAAGACGGTGAACTGACCAACGGTCCGGAACTGCAGGACGACCTGTTCGTTGGTGCTGCGCTGGGTATCGAACTGACTCCGTGGCTGGGTTTCGAAGCCGAGTATAACCAGGTTAAGGGTGACGTGGATGGCCTGGCAGCGGGTGCTGAATACAAACAGAAACAGATCAACGGTAACTTCTACGTTACCAGCGACCTGATTACCAAGAACTATGACTCTAAAATCAAACCGTATGTTCTGCTGGGTGCGGGCCACTACAAATACGAAATCCCGGACCTTTCCTATCACAACGACGAGGAAGGCACTCTGGGTAACGCGGGTGTTGGTGCTTTCTGGCGTCTGAACGACGCTCTGTCTCTGCGTACCGAAGCTCGTGGTACCTATAACGAAGCTGCTGCTGCTAAAGAAGCTGCTGCTGCTAAAGGCTCTATCGAAGCTATCGTAGGTGGTTACAACTTCTACCAGTCCAAGTTTAACCGTGCGCTCCAGGGCTGGCGCCAGCCGGGCTCTACCATTAAACCTTTCCTGTACGCTCTGGCTCTGGAACGTGGCATGACCCCGTACAGCATGGTAAACGATTCTCCGATCACTATTGGTAAATGGACCCCAAAAAATTCTGACGGCCGTTACCTGGGTATGATCCCGCTGCGTCGCGCTCTGTACCTGTCCCGTAACACTGTATCCGTTCGTCTGCTGCAGACTGTTGGCATCGAACGTACCCGCCAACTGTTTATGGATTTCGGTCTGCAGGAAGACCAGATTCCACGTAACTACACTATCGCTCTGGGCACTCCGCAGGTACTGCCGATCCAGATGGCTACCGGCTACGCTACTTTCGCTAATGGCGGCTACCGTGTTCAGCCACATTTCATCCAGCGTATCGAAGACGCGTATGGTAAAGTAATTTACGAAGCTAAACCGGAATATAAGGATCC。

5.一种用于制备如权利要求4所述的鲍曼不动杆菌表面蛋白OmpA及ponA的方法,其特征在于:所述方法包括:

分别获取鲍曼不动杆菌表面蛋白OmpA及表面蛋白ponA胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列,优化肽段基因编码序列,并将优化后的肽段基因编码序列用刚性连接肽的编码序列进行连接,形成融合基因;所述鲍曼不动杆菌表面蛋白OmpA及表面蛋白ponA在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为AJF83030及ADX05080;所述刚性连接肽的序列是eaaakeaaak;同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为OmpPon;

所述OmpPon的基因全序列是:

CATATGCTGGGTTACACCTTCCAGGATACTCAGCACAACAACGGCGGTAAAGACGGTGAACTGACCAACGGTCCGGAACTGCAGGACGACCTGTTCGTTGGTGCTGCGCTGGGTATCGAACTGACTCCGTGGCTGGGTTTCGAAGCCGAGTATAACCAGGTTAAGGGTGACGTGGATGGCCTGGCAGCGGGTGCTGAATACAAACAGAAACAGATCAACGGTAACTTCTACGTTACCAGCGACCTGATTACCAAGAACTATGACTCTAAAATCAAACCGTATGTTCTGCTGGGTGCGGGCCACTACAAATACGAAATCCCGGACCTTTCCTATCACAACGACGAGGAAGGCACTCTGGGTAACGCGGGTGTTGGTGCTTTCTGGCGTCTGAACGACGCTCTGTCTCTGCGTACCGAAGCTCGTGGTACCTATAACGAAGCTGCTGCTGCTAAAGAAGCTGCTGCTGCTAAAGGCTCTATCGAAGCTATCGTAGGTGGTTACAACTTCTACCAGTCCAAGTTTAACCGTGCGCTCCAGGGCTGGCGCCAGCCGGGCTCTACCATTAAACCTTTCCTGTACGCTCTGGCTCTGGAACGTGGCATGACCCCGTACAGCATGGTAAACGATTCTCCGATCACTATTGGTAAATGGACCCCAAAAAATTCTGACGGCCGTTACCTGGGTATGATCCCGCTGCGTCGCGCTCTGTACCTGTCCCGTAACACTGTATCCGTTCGTCTGCTGCAGACTGTTGGCATCGAACGTACCCGCCAACTGTTTATGGATTTCGGTCTGCAGGAAGACCAGATTCCACGTAACTACACTATCGCTCTGGGCACTCCGCAGGTACTGCCGATCCAGATGGCTACCGGCTACGCTACTTTCGCTAATGGCGGCTACCGTGTTCAGCCACATTTCATCCAGCGTATCGAAGACGCGTATGGTAAAGTAATTTACGAAGCTAAACCGGAATATAAGGATCC;

所述OmpPon基因编码的蛋白质序列是:

MLGYTFQDTQHNNGGKDGELTNGPELQDDLFVGAALGIELTPWLGFEAEYNQVKGDVDGLAAGAEYKQKQINGNFYVTSDLITKNYDSKIKPYVLLGAGHYKYEIPDLSYHNDEEGTLGNAGVGAFWRLNDALSLRTEARGTYNEAAAAKEAAAAKGSIEAIVGGYNFYQSKFNRALQGWRQPGSTIKPFLYALALERGMTPYSMVNDSPITIGKWTPKNSDGRYLGMIPLRRALYLSRNTVSVRLLQTVGIERTRQLFMDFGLQEDQIPRNYTIALGTPQVLPIQMATGYATFANGGYRVQPHFIQRIEDAYGKVIYEAKPEY;

所述OmpPon基因编码的蛋白质序列为鲍曼不动杆菌表面蛋白OmpA的31‑173 aa及表面蛋白ponA的406‑572 aa;两段蛋白序列中间以刚性连接肽eaaakeaaak进行连接;

将OmpPon的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET‑28a(+),转入E.coli 

2+

BL21(DE3)菌中,用IPTG诱导重组大肠杆菌表达,用Ni 亲和层析法纯化重组OmpPon蛋白。

6.一种用于制备抗鲍曼不动杆菌表面蛋白OmpA及ponA多克隆抗体的方法,其特征在于:所述方法是:

将根据权利要求5所述的重组OmpPon蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔,抽血进行效价测定,分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化,最终获得抗鲍曼不动杆菌OmpA及ponA蛋白多克隆抗体,用封闭液稀释至终浓度为20µg/mL;所述封闭液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2 g/L,氯化钠 8.5 g/L,牛血清白蛋白10 g/L,所述封闭液的pH是7.4。

7.一种高灵敏度的鲍曼不动杆菌抗原Elisa测定试剂盒,其特征在于:所述一种高灵敏度的鲍曼不动杆菌抗原Elisa测定试剂盒包括包被如权利要求3制备得到的抗鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及Pilf的多克隆抗体的酶标板、如权利要求6制备得到的抗鲍曼不动杆菌表面蛋白OmpA及ponA多克隆抗体、鲍曼不动杆菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液;所述鲍曼不动杆菌阳性对照是灭活的鲍曼不动杆菌菌液;所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液;所述洗涤液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠

0.2 g/L,氯化钠 8.5 g/L,Tween‑20 0.5mL/L,所述洗涤液的pH=7.4;所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG;所述酶显色底物是TMB显色液;所述终止液是1M HCL溶液。

8.一种高灵敏度的鲍曼不动杆菌抗原Elisa测定试剂盒的制备方法,其特征在于:所述一种高灵敏度的鲍曼不动杆菌抗原Elisa测定试剂盒包括包被如权利要求3制备得到的抗鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及Pilf的多克隆抗体的酶标板、如权利要求6制备得到的抗鲍曼不动杆菌表面蛋白OmpA及ponA多克隆抗体、鲍曼不动杆菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液;所述鲍曼不动杆菌阳性对照是灭活的鲍曼不动杆菌菌液;所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液;所述洗涤液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4 g/L,磷酸二氢钠0.2 g/L,氯化钠 8.5 g/L,Tween‑20 0.5 mL/L,所述洗涤液的pH=7.4;所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG;所述酶显色底物是TMB显色液;所述终止液是1M HCL溶液;

所述包被抗鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及Pilf的多克隆抗体的酶标板的制备方法是:

1)制备抗鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及Pilf多克隆抗体;

2)抗鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及Pilf多克隆抗体的包被:

用PBS缓冲液将步骤1)制备得到的抗鲍曼不动杆菌表面蛋白Fhue及Pilf多克隆抗体稀释至浓度为10µg/mL,按100µL/孔的量包被96孔EIA高效结合酶标板,37℃ 2小时;取出后用

250µL洗涤液洗板三次,甩干;用含有1% BSA的洗涤液作为封闭液,按250µL/孔的量加入酶标板,37℃封闭1小时;取出后用250µL洗涤液洗板3次,每次一分钟,甩干,干燥后密封保存;

其中,所述PBS缓冲液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2 g/L,氯化钠 8.5 g/L;所述PBS缓冲液的pH是7.4;

所述洗涤液的组分及含量是:磷酸氢二钠1.4g/L,磷酸二氢钠0.2 g/L,氯化钠 8.5 g/L,Tween‑20 0.5mL/L,所述洗涤液的pH是7.4;

所述封闭液是含1% BSA的洗涤液的水溶液,所述封闭液的pH是7.4。