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专利号: 2019110700991
申请人: 桂林医学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种特异靶向小鼠Gaa基因的sgRNA导向核苷酸片段,其特征在于,所述sgRNA对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中的任意一种序列。

2.一种利用权利要求1所述的特异靶向小鼠Gaa基因的sgRNA导向序列编辑小鼠Gaa基因的方法,其特征在于,包括如下步骤:

步骤1:在权利要求1所述的特异靶向小鼠Gaa基因的sgRNA导向序列的5'端加上accg合成得到正向寡核苷酸序列;

同时根据权利要求1所述的特异靶向小鼠Gaa基因的sgRNA导向序列获得其对应的DNA互补链,并且在DNA互补链的5'端加上aaac合成得到反向寡核苷酸序列;

将正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列退火,形成具有粘性末端的双链DNA片段;

步骤2:利用Bsa I限制性内切酶酶切SEQ ID NO.5所示的目标载体pGL3‑U6‑sgRNA质粒,得到酶切产物pGL3‑U6‑sgRNA‑Bsa I;

步骤3:将步骤1得到的具有粘性末端的双链DNA片段和步骤2得到的酶切产物pGL3‑U6‑sgRNA‑Bsa I连接,将连接产物转化感受态大肠杆菌并涂布于氨苄抗性的LB培养基上,37℃过夜培养20h后,挑取单克隆并用SEQ ID NO.6所示的通用引物U6通过测序鉴定出阳性克隆,对阳性克隆摇菌、提取质粒,得到pGL3‑U6‑Gaa‑sgRNA质粒;

步骤4:将步骤3得到的pGL3‑U6‑Gaa‑sgRNA质粒和SEQ ID NO.7所示的pST1374‑NLS‑flag‑linker‑Cas9表达质粒,共转染小鼠3T3细胞,经药物筛选后,得到阳性的sgRNA‑Cas9共转染细胞;

步骤5:将步骤4得到的阳性的sgRNA‑Cas9共转染细胞进行细胞裂解,以得到的细胞裂解液为模板进行打靶位点DNA的PCR扩增反应,取打靶位点DNA的PCR扩增产物进行Sanger测序,如果打靶位点出现套峰,则初步确认发生了基因编辑;

步骤6:TA克隆测序分析步骤5初步确认发生了基因编辑的打靶位点的基因型,并获得基因编辑后的小鼠细胞。

3.根据权利要求2所述的编辑小鼠Gaa基因的方法,其特征在于,步骤1中,所述退火的反应体系具体为:10μM正向寡核苷酸,5μL;10μM反向寡核苷酸,5μL;10×T7 Endonuclease I buffer,2μL;ddH2O,8μL;反应程序具体为:95℃,5min;95℃到85℃,‑1℃/循环,共10个循环;85℃到25℃,‑0.1℃/循环,共600个循环,退火产物‑20℃保存。

4.根据权利要求2所述的编辑小鼠Gaa基因的方法,其特征在于,步骤2中,所述酶切的反应体系具体为:pGL3‑U6‑sgRNA质粒,2μg;10×酶切buffer,2μL;Bsa I限制性内切酶,2μL;补充ddH2O至总体积20μL,将酶切反应体系置于37℃反应3h。

5.根据权利要求2所述的编辑小鼠Gaa基因的方法,其特征在于,步骤3中,所述转化感受态大肠杆菌的具体方法为:取5μL连接产物快速加入到30μL感受态大肠杆菌中,充分混匀,冰上静置25min,42℃水浴热激90s,冰上冷却2min,加入150μL的LB液体培养基,转速为

220转/min,37℃活化30min,然后涂布于氨苄抗性的LB培养基表面;所述具有氨苄抗性的LB培养基中,氨苄青霉素的浓度为50μg/mL;所述摇菌的温度为37℃,转速为220转/min,涂布于培养基上后,倒置过夜培养;所述提取质粒采用去内毒素质粒中提试剂盒。

6.根据权利要求2所述的编辑小鼠Gaa基因的方法,其特征在于,步骤4中,所述药物为浓度为10μg/ml的嘌呤霉素和浓度为20μg/ml的杀稻瘟菌素;所述小鼠3T3细胞在转染前,先接种培养于含5%v/v胎牛血清的DMEM完全培养基中,于37℃,5%CO2培养箱中培养,每2d‑

3d更换新鲜培养基,待细胞汇合度达到80%‑90%后,以0.25%胰蛋白酶消化,然后传代于6孔板中,16h‑18h后,待细胞汇合度达到80%‑90%时进行转染。

7.根据权利要求2所述的编辑小鼠Gaa基因的方法,其特征在于,步骤5中,所述打靶位点DNA的PCR扩增反应的体系为:细胞裂解液2μL,上游引物1μL,下游引物1μL,dNTP Mixture 

2μL,TaKaRa Ex Taq 1μL,10×Ex Taq Buffer 2.5μL,灭菌水补充至25μL;所述打靶位点DNA的PCR扩增反应的程序为:95℃,5min;95℃,20s,72℃,20s,‑1℃/循环,72℃,25s,共10个循环;95℃,20s,62℃,20s,72℃,25s,共25个循环;72℃,5min,16℃,无穷。

8.根据权利要求7所述的编辑小鼠Gaa基因的方法,其特征在于,所述上游引物的序列如SEQ ID NO.8所示;所述下游引物的序列如SEQ ID NO.9所示。

9.根据权利要求2所述的编辑小鼠Gaa基因的方法,其特征在于,步骤6中,所述TA克隆测序具体为:将步骤5得到的打靶位点的PCR扩增产物进行胶回收纯化,将纯化后的DNA连接于质粒载体上,得到连接产物;将连接产物转化感受态大肠杆菌并涂含氨苄抗性的LB培养基上,37℃过夜培养20h后,进行菌落PCR反应验证,筛选出阳性克隆,并将阳性克隆进行Sanger测序。

10.根据权利要求9所述的编辑小鼠Gaa基因的方法,其特征在于,所述连接的反应体系为:PCR纯化产物40ng、Solution I 2.5μL和PMD19载体0.5μL,加水补充至5μL;所述转化感受态大肠杆菌的具体方法为:取5μL连接产物快速加入到30μL感受态大肠杆菌中,充分混匀,冰上静置25min,42℃水浴热激90s,冰上冷却2min,加入150μL的LB液体培养基,转速为

220转/min,37℃活化30min,然后涂布于氨苄抗性的LB培养基表面;所述具有氨苄抗性的LB培养基中,氨苄青霉素的浓度为50μg/mL;所述菌落PCR反应的体系为:菌落水溶液1μL,Premix Taq酶5μL,上游引物0.5μL,下游引物0.5μL,灭菌水3μL;所述菌落PCR反应的程序为:95℃,5min;95℃,20s,60℃,20s,72℃,25s,26个循环;72℃,5min;所述上游引物的序列如SEQ ID NO.10所示;所述下游引物的序列如SEQ ID NO.11所示。