1.一种特异靶向小鼠Galt基因的sgRNA导向核苷酸片段,其特征在于,所述sgRNA对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中的任意一种序列。
2.一种利用权利要求1所述的特异靶向小鼠Galt基因的sgRNA导向序列编辑小鼠Galt基因的方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤1:在权利要求1所述的特异靶向小鼠Galt基因的sgRNA导向序列的5'端加上accg合成得到正向寡核苷酸序列;
同时根据权利要求1所述的特异靶向小鼠Galt基因的sgRNA导向序列获得其对应的DNA互补链,并且在DNA互补链的5'端加上aaac合成得到反向寡核苷酸序列;
将正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列退火,形成具有粘性末端的双链DNA片段;
步骤2:利用Bsa I限制性内切酶酶切如SEQ ID NO.4所示的目标载体pGL3-U6-sgRNA质粒,得到酶切产物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I;
步骤3:将步骤1得到的具有粘性末端的双链DNA片段和步骤2得到的酶切产物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I连接,将连接产物转化感受态大肠杆菌并涂布于具有氨苄抗性的LB固体培养基上,37℃过夜培养20h后,挑取单克隆并用如SEQ ID NO.5所示的通用引物U6通过测序鉴定出阳性克隆,对阳性克隆摇菌、提取质粒,得到pGL3-U6-Galt-sgRNA质粒;
步骤4:将步骤3得到的pGL3-U6-Galt-sgRNA质粒和如SEQ ID NO.6所示的pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表达质粒,共转染小鼠3T3细胞,经药物筛选后,得到阳性的sgRNA-Cas9共转染细胞;
步骤5:将步骤4得到的阳性的sgRNA-Cas9共转染细胞进行细胞裂解,以得到的细胞裂解液为模板进行打靶位点DNA的PCR扩增反应,取打靶位点DNA的PCR扩增产物进行Sanger测序,如果打靶位点出现套峰,则初步确认发生了基因编辑;
步骤6:TA克隆测序分析步骤5初步确认发生了基因编辑的打靶位点的基因型,并获得基因编辑后的小鼠细胞。
3.根据权利要求2所述的编辑小鼠Galt基因的方法,其特征在于,步骤1中,所述退火的反应体系具体为:10μM正向寡核苷酸,5μL;10μM反向寡核苷酸,5μL;10×T7 Endonuclease I buffer,2μL;ddH2O,8μL;反应程序具体为:95℃,5min;95℃到85℃,-1℃/循环,共10个循环;85℃到25℃,-0.1℃/循环,共600个循环,退火产物-20℃保存。
4.根据权利要求2所述的编辑小鼠Galt基因的方法,其特征在于,步骤2中,所述酶切的反应体系具体为:pGL3-U6-sgRNA质粒,2μg;10×酶切buffer,2μL;Bsa I限制性内切酶,2μL;补充ddH2O至总体积20μL,将酶切反应体系置于37℃反应3h。
5.根据权利要求2所述的编辑小鼠Galt基因的方法,其特征在于,步骤3中,所述转化感受态大肠杆菌的具体方法为:取5μL连接产物快速加入到30μL感受态大肠杆菌中,充分混匀,冰上静置25min,42℃水浴热激90s,冰上冷却2min,加入150μL的LB液体培养基,转速为
220转/min,37℃活化30min,然后涂布于含氨苄抗性的LB培养基表面;所述含氨苄抗性的LB培养基中,氨苄青霉素的浓度为50μg/mL;所述摇菌的温度为37℃,转速为220转/min,涂布于培养基上后,倒置过夜培养;所述提取质粒采用去内毒素质粒中提试剂盒。
6.根据权利要求2所述的编辑小鼠Galt基因的方法,其特征在于,步骤4中,所述药物为浓度为10μg/ml的嘌呤霉素和浓度为20μg/ml的杀稻瘟菌素;所述小鼠3T3细胞在转染前,先接种培养于含5%v/v胎牛血清的DMEM完全培养基中,于37℃,5%CO2培养箱中培养,每2d-
3d更换新鲜培养基,待细胞汇合度达到80%-90%后,以0.25%胰蛋白酶消化,然后传代于6孔板中,16h-18h后,待细胞汇合度达到80%-90%时进行转染。
7.根据权利要求2所述的编辑小鼠Galt基因的方法,其特征在于,步骤5中,所述打靶位点DNA的PCR扩增反应的体系为:细胞裂解液2μL,上游引物1μL,下游引物1μL,dNTP Mixture
2μL,TaKaRa Ex Taq 1μL,10×Ex Taq Buffer 2.5μL,灭菌水补充至25μL;所述打靶位点DNA的PCR扩增反应的程序为:95℃,5min;95℃,20s,57℃,20s,72℃,25s,共35个循环;72℃,5min,16℃,无穷。
8.根据权利要求7所述的编辑小鼠Galt基因的方法,其特征在于,所述上游引物的序列如SEQ ID NO.7所示;所述下游引物的序列如SEQ ID NO.8所示。
9.根据权利要求2所述的编辑小鼠Galt基因的方法,其特征在于,步骤6中,所述TA克隆测序具体为:将步骤5得到的打靶位点的PCR扩增产物进行胶回收纯化,将纯化后的DNA连接于质粒载体上,得到连接产物;将连接产物转化感受态大肠杆菌并涂布于氨苄抗性的LB培养基上,37℃过夜培养20h后,进行菌落PCR反应验证,筛选出阳性克隆,并将阳性克隆进行Sanger测序。
10.根据权利要求9所述的编辑小鼠Galt基因的方法,其特征在于,所述连接的反应体系为:PCR纯化产物40ng、Solution I 2.5μL和PMD19载体0.5μL,加水补充至5μL;所述转化感受态大肠杆菌的具体方法为:取5μL连接产物快速加入到30μL感受态大肠杆菌中,充分混匀,冰上静置25min,42℃水浴热激90s,冰上冷却2min,加入150μL的LB液体培养基,转速为
220转/min,37℃活化30min,然后涂布于氨苄抗性的LB培养基表面;所述具有氨苄抗性的LB培养基中,氨苄青霉素的浓度为50μg/mL;所述菌落PCR反应的体系为:菌落水溶液1μL,Premix Taq酶5μL,上游引物0.5μL,下游引物0.5μL,灭菌水3μL;所述菌落PCR反应的程序为:95℃,5min;95℃,20s,60℃,20s,72℃,25s,26个循环;72℃,5min;所述上游引物的序列如SEQ ID NO.9所示;所述下游引物的序列如SEQ ID NO.10所示。