1.一种犬腺病毒Ⅰ型灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将无血清驯化后的MDCK细胞传代，待细胞汇合度为90%，将转瓶中的培养液全部倒掉，加入0.9%（w/v）NaCl洗涤液 100mL，洗涤细胞，倒掉洗涤液，再重复洗涤一次；

（2）加入犬腺病毒Ⅰ型无血清培养基及其稀释过的稀释倍数为1000倍的犬腺病毒Ⅰ型，使病毒感染复数为1TCID50，采用转瓶培养，转速为1圈/5min,培养温度为38.5℃，密闭培养

96h后收获病毒；

（3）反复冻融3次，5000g/min，离心5min，去除细胞碎片，取上清测定病毒的滴度，调整7

病毒的效价为10TCID50/mL；

（4）病毒灭活：在每1L病毒液中加入甲醛2mL，即甲醛终浓度为0.2%；放置于 37℃，90r/min，灭活24 h；

（5）甲醛的中和：将灭活的病毒液放置在冰上，用搅拌头直径为5cm的三叶浆式搅拌器进行搅拌，将转速调至1000r/min，往灭活的病毒液中加入终浓度为0.05%的亚硫酸钠溶液，搅拌30min，充分中和甲醛；

（6）按“抗原：佐剂=98:2”比重比例缓慢加入MontanideTM PET GEL A佐剂，用搅拌头直径为5cm的三叶浆式搅拌器进行搅拌，将转速调至1500r/min，在10min内加完佐剂；继续以

1500r/min的转速搅拌30-40min；

（7）一次性加入终浓度为20μg/mL的硫柳汞，将转速调至800r/min，持续搅拌10min；

（8）置于4℃，静止30min以消除气泡，乳化；

（9）分装、压盖、保存：往无菌疫苗瓶中灌装疫苗，40mL/瓶，压盖；放4℃保存；

所述犬腺病毒Ⅰ型无血清培养基是以MEM培养基为基础培养基，添加细胞生长促进因子和促病毒增殖因子，所述细胞生长促进因子由表皮生长因子EGF、转移生长因子TGF-β、L-赖氨酸和葡萄糖组成；所述促病毒增殖因子由EDTA-Na2、牛磺酸和皮质醇组成，所述无血清培养基中添加了终浓度为0.05µg/mL～0.4 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.06µg/mL～

0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为0.1µg/mL～5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为2µg/mL～5µg/mL的葡萄糖，终浓度为0.05µg/mL～0.15μg/mL的EDTA-Na2，终浓度为50µg/mL -75µg/mL的牛磺酸，终浓度为10µg/mL -15µg/mL的皮质醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无血清驯化后的MDCK细胞采用如下方法制备得到：（1）将长成单层的犬肾细胞MDCK用pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液，洗涤2次；

（2）加入0.25%的胰蛋白酶消化，待细胞变圆时，弃掉胰蛋白酶溶液；

（3）加入含有终浓度为5%胎牛血清（v/v）的MEM培养基、加入终浓度为2-10µg/mL的泰勒菌素，摇匀，置于37℃密闭培养24 小时；

（4）将培养温度设置为38.5℃，持续密闭培养72小时；

（5）细胞长满单层，以1:10的比例接种，进行传代，按照步骤（1）-（4）培养3代次，得到种子细胞；

（6）将长成单层的犬肾细胞MDCK用pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液，洗涤2次；

（7）加入0.25%的胰蛋白酶消化，待细胞变圆时，弃掉胰蛋白酶溶液；

（8）加入商品化的MEM培养基培养300 mL，按照体积比添加终浓度为5%的胎牛血清；加入终浓度为0.05µg/mL～0.2 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.01µg/mL～0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为0.1µg/mL～5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为2µg/mL～5µg/mL葡萄糖，采用转瓶培养，将培养温度设置为38.5℃，密闭培养96小时;（9）细胞长满单层，以1:10的比例接种，进行连续传代，每个代次，培养基中的血清浓度在上一个代次血清浓度基础上降低0.2%，每个代次中均添加：终浓度为0.05µg/mL～0.2 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.01µg/mL～0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为

0.1µg/mL～5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为2µg/mL～5µg/mL葡萄糖，采用转瓶培养，将培养温度设置为38.5℃；

（10）按照第（9）步方法连续传代培养至无血清培养时，继续传代培养，每个代次不再添加胎牛血清，每个代次均添加：终浓度为0.05µg/mL～0.2 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.01µg/mL～0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为0.1µg/mL～5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为2µg/mL～5µg/mL葡萄糖，连续传代50代次，即得到无血清驯化后的MDCK细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述犬腺病毒Ⅰ型无血清培养基是以MEM培养基为基础培养基，添加细胞生长促进因子和促病毒增殖因子，所述细胞生长促进因子由表皮生长因子EGF、转移生长因子TGF-β、L-赖氨酸和葡萄糖组成；所述促病毒增殖因子由EDTA-Na2、牛磺酸和皮质醇组成，所述无血清培养基中添加了终浓度为0.1 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.15µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为2.5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为3.5µg/mL的葡萄糖，终浓度为0.1μg/mL的EDTA-Na2，终浓度为50µg/mL的牛磺酸，终浓度为10µg/mL的皮质醇。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述犬腺病毒Ⅰ型毒株为CAV-ZY 180711。