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专利号: 2019110808366
申请人: 衡阳师范学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种犬腺病毒Ⅰ型无血清培养基,其特征在于,由基础培养基、细胞生长促进因子和促病毒增殖因子组成,所述犬腺病毒Ⅰ型无血清培养基是以MEM培养基为基础培养基,添加细胞生长促进因子和促病毒增殖因子,所述细胞生长促进因子由表皮生长因子EGF、转移生长因子TGF-β、L-赖氨酸和葡萄糖组成;所述促病毒增殖因子由EDTA-Na2、牛磺酸和皮质醇组成,所述无血清培养基中添加了终浓度为0.05µg/mL~0.4 µg/mL的表皮生长因子EGF,终浓度为0.06µg/mL~0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β,终浓度为0.1µg/mL~5µg/mL的L-赖氨酸,终浓度为2µg/mL~5µg/mL的葡萄糖,终浓度为0.05µg/mL~0.15μg/mL的EDTA-Na2,终浓度为50µg/mL -75µg/mL的牛磺酸,终浓度为10µg/mL -15µg/mL的皮质醇。

2.根据权利要求1所述的犬腺病毒Ⅰ型无血清培养基,其特征在于,所述无血清培养基中添加了终浓度为0.1 µg/mL的表皮生长因子EGF,终浓度为0.15µg/mL的转移生长因子TGF-β,终浓度为2.5µg/mL的L-赖氨酸,终浓度为3.5µg/mL的葡萄糖,终浓度为0.1μg/mL的EDTA-Na2,终浓度为50µg/mL的牛磺酸,终浓度为10µg/mL的皮质醇。

3.根据权利要求1所述的犬腺病毒Ⅰ型无血清培养基,其特征在于,所述无血清培养基中添加了终浓度为0.2µg/mL的表皮生长因子EGF,终浓度为0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β,终浓度为5µg/mL的L-赖氨酸,终浓度为5µg/mL的葡萄糖,终浓度为0.15μg/mL的EDTA-Na2,终浓度为75µg/mL的牛磺酸,终浓度为15µg/mL的皮质醇。

4.一种犬腺病毒Ⅰ型无血清培养工艺,其特征在于,包括如下步骤:

步骤一,犬肾细胞MDCK的无血清培养驯化工艺:

采用转瓶培养工艺,将长成单层的MDCK细胞用胰酶消化,制备108个细胞/mL的悬液5 mL接种于转瓶,加入商品化的MEM培养基培养300 mL,按照体积比添加终浓度为5%的胎牛血清,终浓度为0.05µg/mL~0.2 µg/mL的表皮生长因子EGF,终浓度为0.01µg/mL~0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β,终浓度为0.1µg/mL~5µg/mL的L-赖氨酸,终浓度为2µg/mL~5µg/mL的葡萄糖,采用转瓶培养,将培养温度设置为38.5℃,密闭培养96小时,细胞长满单层,以1:

10的比例接种,进行连续传代;每个代次,培养基中的血清浓度在上一个代次血清浓度基础上降低0.2%,每个代次的培养基中均添加:终浓度为0.05µg/mL~0.2 µg/m的表皮生长因子EGF,终浓度为0.01µg/mL~0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β,终浓度为0.1µg/mL~5µg/mL的L-赖氨酸,终浓度为2µg/mL~5µg/mL的葡萄糖,采用转瓶培养,将培养温度设置为38.5℃,传代培养至无血清培养时,继续传代培养,每个代次不再添加血清,每个代次的培养基中均添加:终浓度为0.05µg/mL~0.2 µg/m的表皮生长因子EGF,终浓度为0.01µg/mL~0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β,终浓度为0.1µg/mL~5µg/mL的L-赖氨酸,终浓度为2µg/mL~5µg/mL的葡萄糖,连续传代50代次,细胞生产特性良好,得到无血清驯化后的MDCK细胞系;

步骤二、犬腺病毒Ⅰ型的无血清培养工艺:

将上述得到的无血清驯化后的MDCK细胞系,采用同样方法传代,待细胞汇合度为90%,将转瓶中的培养液全部倒掉,加入0.9%(w/v)NaCl洗涤液100mL,洗涤细胞,倒掉洗涤液,再重复洗涤一次,加入权利要求1-3中任一项所述的犬腺病毒Ⅰ型无血清培养基、及其稀释过的稀释倍数为1000倍的犬腺病毒Ⅰ型,使病毒感染复数为1TCID50,充分混匀;采用转瓶培养,培养温度为38.5℃,密闭培养48~72小时,当细胞病变达到90~100%时,收获病毒培养液。