1.一株嵌合毒株vSP‑Hub2,其特征在于:利用猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV‑SP制备得到;其中,编码所述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV‑SP的核苷酸序列如SEQ NO.1所示;
所述的嵌合毒株vSP‑Hub2的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。
2.权利要求1所述的嵌合毒株vSP‑Hub2的制备方法,其特征在于包括以下步骤:(1)扩增横跨嵌合毒株vSP‑Hub2全基因组的A、B、C、D1、Hub2、N6个片段,克隆入质粒中,得到重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C、重组质粒D1、重组质粒Hub2、重组质粒N;在构建过程中,对片段做以下改造:
1)将酶切位点BsmBI、Not I以及T7启动子引入A片段的始端;
2)在D1片段的始端和片段N的末端分别引入一个BsmBI酶切位点;
3)将片段Hub2放入重组疫苗株PRRSV‑SP的相应编码区域13897‑15008nt;
(2)将步骤(1)得到的重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C、重组质粒D1、重组质粒Hub2、重组质粒N扩增,提取质粒,酶切,回收,连接,得到5’端含T7启动子,3’端含35个碱基A的嵌合毒株vSP‑Hub2的全长cDNA;
(3)将步骤(2)得到的嵌合毒株vSP‑Hub2的全长cDNA纯化,体外转录,得到嵌合毒株vSP‑Hub2的mRNA,电转至细胞,培养,当细胞出现50%以上凋亡时‑80℃冻融3次,取上清感染细胞,重复冻融和感染的步骤3次,取上清,即得嵌合毒株vSP‑Hub2;
步骤(1)中的片段A、片段B、片段C、片段D1和片段N是以提取的重组疫苗株PRRSV‑SP的RNA经逆转录获得的cDNA为模板,采用特异性引物和高保真DNA聚合酶扩增得到;
步骤(1)中的片段A覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV‑SP的第1~
3130位核苷酸;
步骤(1)中的片段B覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV‑SP的第
3058~5720位核苷酸;
步骤(1)中的片段C覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV‑SP的第
5690~10581位核苷酸;
步骤(1)中的片段D1覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV‑SP的第
10576~13902位核苷酸;
步骤(1)中的片段Hub2覆盖区域是嵌合毒株vSP‑Hub2的第13897~15008位核苷酸;
步骤(1)中的片段N覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV‑SP的第
15004~15520位核苷酸;
步骤(1)中所述的质粒为pCR‑TOPO‑2.1、pCR‑XL‑TOPO、pUCIDT或pGEM;
步骤(1)中的片段A适用的质粒为pCR‑TOPO‑2.1;
步骤(1)中的片段B适用的质粒为pCR‑TOPO‑2.1;
步骤(1)中的片段C适用的质粒为pCR‑XL‑TOPO;
步骤(1)中的片段D1适用的质粒为pGEM;
步骤(1)中的片段Hub2适用的质粒为pUCIDT;
步骤(1)中的片段N适用的质粒为pGEM;
用于扩增的特异性引物按照A、B、C、D1、N5个片段的顺序依次如下:F5: 5’‑gcgtctcgcggccgctaatacgactcactataggatgacgtataggtgttggct‑3’;
R5: 5’‑cacttcaagaacgtccccg‑3’t;
F6: 5’‑gtctgcatcctcgcatactg‑3’;
R6: 5’‑gaagggacccgagctgagac‑3’;
F7: 5’‑ctgtttaccccgtctcagct‑3’;
R7: 5’‑gcgtctcatcacagatattctgtcc‑3’;
F8: 5’‑ gcgtctctgtgatgccatccagcc‑3’;
R8 5’‑atcgtctccaacatacttaaacattc‑3’;
F9: 5’‑aacgtctcaaataacaacggcaaac‑3’;
R9:5’‑ gcgtctcttttttttttttttttttttttttttttttttttttaatttcggccgcatggttt‑3’;
步骤(2)中所述的酶切具体为:重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C以及重组质粒N采用BsmBI酶切;重组质粒D1采用BsmBI和ScaI双酶切;重组质粒Hub2采用BsaI酶切;
步骤(2)中所述的扩增是将重组质粒转化入大肠杆菌中进行扩增;
步骤(2)中所述的连接所用的各片段的摩尔浓度相同;
步骤(3)中所述的纯化是采用苯酚/氯仿/异戊醇抽提纯化;
步骤(3)中所述的体外转录的反应体系和反应条件为:5×缓冲液4μL、2×NTP/CAP 10μL、30mMGTP1.5μL,模板2.5μL、T7RNA聚合酶2uL,37℃孵育3h;
步骤(3)中所述的电转的条件如下:4mm电击杯、450 V、50 μF条件下进行一次脉冲;
步骤(3)中所述的培养是将含体积比为2%的FBS的DMEM培养基加入电转后的细胞,培养
3 4天得到。
~
3.权利要求1所述的嵌合毒株vSP‑Hub2在制备弱毒疫苗中的应用。