1.单碱基连续延伸流式靶向测序法，其特征是包括以下步骤：

(1)将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，得包被微球；

(2)将包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液混合，所得混合物进行孵育杂交；

(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；

(4)将上一步与核糖3'-OH被保护的dNTP混合后进行孵育的微球进行洗涤，再加入核糖

3'-OH去保护剂，混合均匀；

(5)缓冲液洗涤、悬浮上一步的微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；

(6)不断重复上述（4）和（5）的步骤，测序待测核酸片段n个碱基共需连续制备n群微球，共得到与荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合后进行孵育的n群微球；

(7)如果利用上述步骤（6）的n群微球无法检测出所有的碱基，则替换步骤（3）和（5）的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，采用步骤（2）-（6）继续制备微球，共得到4×n或2×n群微球；

(8)将步骤（6）和（7）中得到的4×n、或2×n、或n群微球洗涤、悬浮后，上样流式细胞仪进行检测，即可得到待测核酸片段的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP、ddGTP、ddCTP和ddUTP/ddTTP中的至少一种；

优选的，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP、dGTP、dCTP和dUTP/dTTP中的至少一种；

优选的，所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、dTTP/dUTP、dGTP和dCTP的混合物；

优选的，微球上包被的是引导待测核酸片段合成的修饰单向引物时，步骤（2）中加入的是含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段；微球上包被的是含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段时，步骤（2）中加入的是引导待测核酸片段合成的修饰单向引物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：所述荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP被下述任意一种或多种的荧光物质进行标记：异硫氰酸荧光素、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、菁染料Cy5、德克萨斯红、菁染料Cy3、菁染料Cy7、羟基荧光素、萤光黄、菁染料Cy5.5、罗丹明

110、ROX、罗丹明6G、TAMRA。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤（3）和（5）中加入任意两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，得到n群微球，然后将步骤（3）和（5）中的两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP替换为另两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，采用步骤（2）-（6），得到n群微球，共得2n群微球。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，得包被微球；

(2)容器Ⅰ中加入步骤（1）得到的包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液，混匀，进行孵育杂交；

(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，另一部分微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅱ中，容器Ⅰ中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器Ⅱ中加入核酸聚合酶、缓冲液、两种荧光标记的ddNTP或两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器Ⅱ中所得测序微球记为A1；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；

(4)洗涤容器Ⅰ中微球后，容器Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；

(5)缓冲液洗涤、悬浮容器Ⅰ中的微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，另一部分微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅲ中，容器Ⅰ中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器Ⅲ中加入核酸聚合酶、缓冲液、两种荧光标记的ddNTP或两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器Ⅲ中所得测序微球记为A2；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖

3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；

(6)不断重复类似（4）和（5）的步骤，共得到n群加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的测序微球，最后一群测序微球记为An，其中n为待测核酸片段的碱基数目；

(7)容器①中加入步骤（1）得到的包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液，混匀，进行孵育杂交；

(8)缓冲液洗涤、悬浮微球，留存部分微球在容器①中，另一部分微球从容器①中移至容器②中，容器①中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器②中加入核酸聚合酶、缓冲液、与步骤（3）中的不同的另外两种荧光标记的ddNTP或与步骤（3）中的不同的另外两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器②中所得测序微球记为B1；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；

(9)洗涤容器①中微球后，容器①中再加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；

(10)缓冲液洗涤、悬浮容器①中的微球，留存部分微球在容器①中，另一部分微球从容器①中移至新的容器③中，容器①中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器③中加入核酸聚合酶、缓冲液、与步骤（5）中的不同的另外两种荧光标记的ddNTP或与步骤（5）中的不同的另外两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器③中所得测序微球记为B2；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；

(11)不断重复类似（9）和（10）的步骤，共得到n群加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的微球，最后一群微球记为Bn，其中n为待测核酸片段的碱基个数；

(12)将A1-An和B1-Bn这些微球洗涤、悬浮，进一步经流式细胞仪进行检测，可以得到待测核酸片段的碱基序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：步骤（3）和（5）中，所述2种荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP和荧光标记的ddTTP/ddUTP，所述2种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dTTP/dUTP；

步骤（8）和（10）中，所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddGTP和荧光标记的ddCTP，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dGTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dCTP。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征是：所述微球为尺寸均一的微球、尺度编码的微球、不含荧光的微球或荧光编码的微球；

优选的，微球的直径为0.5-50μm ，更优选为1-10μm；

优选的，所述微球为经羧基、氨基、羟基、酰肼基、醛基、氯甲基、环氧乙烷、抗体、核酸适配体、链霉亲和素、poly T、poly A、poly G、poly C、poly U和甲基化CpG结合结构域蛋白、二甲基胺、巯基中的至少一种进行修饰的微球，更优选为羧基化微球。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征是：所述待测核酸片段为单链DNA片段；

优选的，所述核酸聚合酶为DNA依赖的DNA聚合酶；

优选的，所述修饰单向引物是经氨基、羧基、地高辛、生物素、poly A、poly G、poly C、poly T、poly U和甲基中的至少一种进行修饰的单向引物，更优选为经氨基修饰的单向引物。

9.根据权利要求1、2或5所述的方法，其特征是：每次孵育时，孵育体系中微球的终浓度均为5×102个/ml-2.5×108个/ml，核酸聚合酶的终浓度均为2-480 units/ml，每种荧光标记的ddNTP的终浓度均为0.1-50 μmol/L，每种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP的终浓度均为0.1-50 μmol/L，每种核糖3'-OH被保护的dNTP的终浓度均为0.1-50 μmol/L。

10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征是：孵育在下述容器中进行：24孔板孔、24孔滤板孔、96孔板孔、96孔滤板孔、384孔板孔、384孔滤板孔、离心管或EP管，每次孵育所用的容器相同或者不同；

优选的，每次孵育的温度均为20-95℃，更优选为32-70℃；

优选的，每次孵育时，孵育体系的总体积均为10μl-10ml，更优选为10μl-1000μl。