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专利号: 201911173242X
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种酒酒球菌(Oenococcus oeni)工程菌的构建方法,其特征在于,步骤如下:(1)提取植物乳酸杆菌基因组DNA,经PCR扩增,获得脂肪酶基因lipase;

所述PCR扩增的特异引物,核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;

(2)以质粒pMG36e为模板,经PCR扩增,获得带脂肪酶基因的同源臂基因;

所述PCR扩增的特异引物,核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;

(3)分别将步骤(1)制得的脂肪酶基因lipase和步骤(2)制得的带脂肪酶基因的同源臂基因经线性化后,连接,转化至大肠杆菌,筛选,获得质粒pMG36e-lipase;

(4)以pET30a-nisI质粒为模板,经PCR扩增,获得nisI片段;

所述PCR扩增的特异引物,核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示;

(5)以步骤(3)制得的质粒pMG36e-lipase为模板,进行PCR扩增,制得不含有红霉素序列的线性片段;

所述PCR扩增的特异引物,核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示;

(6)将步骤(4)制得的nisI片段与步骤(5)制得的不含有红霉素序列的线性片段经连接后,转化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363感受态细胞,筛选,制得表达载体pMG36n-lipase;

(7)将步骤(6)制得的表达载体pMG36n-lipase转化酒酒球菌Oenococcus oeni感受态细胞,然后在含有Nisin的平板上进行筛选培养,制得酒酒球菌(Oenococcus oeni)工程菌。

2.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(1)中,PCR扩增体系如下,总体系50μl:PCR扩增程序如下:

98℃预变性3min,98℃变性30s,55℃退火30s,68℃延伸1min,35个循环;68℃终延伸

10min。

3.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(2)中,PCR扩增体系如下,总体系50μl:PCR扩增程序如下:

98℃预变性3min,98℃变性30s,50℃退火30s,68℃延伸4min,35个循环;68℃终延伸

10min。

4.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(3)中,筛选为将转化后的大肠杆菌涂布于含浓度为200μg/L红霉素的LB固体平板培养基上,在35~37℃条件下培养20~

28小时,选取转化子,经测序验证,即得;

优选的,所述步骤(4)中,PCR扩增体系如下,总体系50μl:PCR扩增程序如下:

98℃预变性3min,98℃变性30s,55℃退火30s,68℃延伸1min,35个循环;68℃终延伸

10min;

优选的,所述步骤(5)中,PCR扩增体系如下,总体系50μl:PCR扩增程序如下:

98℃预变性3min,98℃变性30s,50℃退火30s,68℃延伸4min,35个循环;68℃终延伸

10min。

5.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(6)中,筛选为将转化后的乳酸乳球菌经复苏培养后,涂布于含浓度为40U/mL乳酸菌素Nisin的M17培养基的平板上,37℃静置培养48h,选取阳性菌落,经测序验证,即得;

进一步优选的,所述复苏培养为在M17复苏培养基中,37℃静置培养2~3h;

进一步优选的,所述M17培养基组份如下:

大豆蛋白胨5.0g/L,酵母提取物5.0g/L,动物蛋白胨5.0g/L,硫酸镁0.25g/L,抗坏血酸

0.5g/L,牛肉浸膏5.0g/L,β-甘油磷酸二钠19g/L,葡萄糖5.0g/L,固体培养基还要添加琼脂

15g/L;

更优选的,所述M17复苏培养基组份如下:

添加了葡萄糖0.5g/L,蔗糖17.1g/L,氯化镁1.0mol/L,氯化钙1.0mol/L的M17培养基。

6.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(7)中的酒酒球菌Oenococcus oeni感受态细胞,采用如下步骤制备:将酒酒球菌Oenococcus oeni使用添加质量百分比2.5~3.5%甘氨酸的mFT80培养基活化,培养至对数期OD600=0.35,离心收集细胞,然后用含0.5mmoL/L蔗糖、10%(体积百分比)甘油溶液室温下冲洗3~5次,制得酒酒球菌Oenococcus oeni感受态细胞;

进一步优选的,所述mFT80培养基组份如下:

牛肉浸粉5.0g/L,酵母粉4.0g/L,磷酸二氢钾0.6g/L,氯化钾0.45g/L,氯化钙0.13g/L,硫酸镁0.13g/L,硫酸锰0.003g/L,吐温80 1mL,L-苹果酸10g/L,果糖35g/L,葡萄糖5.0g/L。

7.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(7)中的转化,条件为:1.25KV,

200Ω,25μF电转1.0秒;

优选的,所述步骤(7)中,含有Nisin的平板为含有浓度15~25U/mL Nisin的mFT80固体培养基;

优选的,所述步骤(7)中,筛选培养,步骤如下:将转化后的酒酒球菌Oenococcus oeni加入含0.5moL/L蔗糖的mFT80培养基中,27~30℃静止培养3~5h,离心取细胞,涂布于含20U/mL Nisin的mFT80固体培养基中,27~30℃静止培养6~8天;

进一步优选的,所述mFT80固体培养基组份如下:添加了琼脂15g/L的mFT80液体培养基。

8.一株酒酒球菌(Oenococcus oeni)工程菌,采用权利要求1所述构建方法制备。

9.权利要求8所述酒酒球菌(Oenococcus oeni)工程菌做为酯类降解菌在制备酒中的应用。

10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述酒为酒精度低于16度的果酒或粮食酒。