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专利号: 2019111746441
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种促进N-乙酰氨基葡萄糖合成的方法,其特征在于,使用GlcN6P感应元器件控制N-乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1的表达来动态调控N-乙酰氨基葡萄糖合成途径;同时利用GlcN6P感应元器件调控表达的dCas9蛋白和三个分别作用于zwf,pfkA与glmM基因的sgRNA表达片段结合后形成的复合体对糖酵解途径、磷酸戊糖途径和肽聚糖合成途径进行动态弱化;所述GlcN6P感应元器件包含有转录因子GamR以及含GamR结合位点的启动子,所述转录因子GamR含NCBI编号为WP_015382651.1的氨基酸序列的第1-235位,所述启动子是PgamA启动子或者将GamR结合位点添加到组成型启动子上构建的杂合启动子。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述启动子PgamA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述N-乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述N-乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1以载体pSTg-GNA1为表达载体,所述载体pSTg-GNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述dCas9蛋白的氨基酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.1所示;所述dCas9蛋白以载体pLCg-dCas9为表达载体进行整合表达,所述载体pLCg-dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述作用于zwf的sgRNA表达片段的核苷酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.2所示;所述作用于pfkA的sgRNA表达片段的核苷酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.3所示;所述作用于glmM的sgRNA表达片段的核苷酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.4所示;所述sgRNA的表达片段通过转化载体psga-zpg整合到重组枯草芽孢杆菌基因组上,所述载体psga-zpg的核苷酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.7所示。

6.如权利要求1-5任一所述的方法,其特征在于,所述方法还包括同时敲除了副产物乙偶姻合成关键基因alsSD。

7.一种重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述重组枯草芽孢杆菌使用GlcN6P感应元器件控制N-乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1的表达来动态调控N-乙酰氨基葡萄糖合成途径;同时利用GlcN6P感应元器件调控表达的dCas9蛋白和三个分别作用于zwf,pfkA与glmM基因的sgRNA表达片段结合后形成的复合体对糖酵解途径、磷酸戊糖途径和肽聚糖合成途径进行动态弱化;所述GlcN6P感应元器件包含有转录因子GamR以及含GamR结合位点的启动子,所述转录因子GamR含NCBI编号为WP_015382651.1的氨基酸序列的第1-235位,所述启动子是PgamA启动子或者将GamR结合位点添加到组成型启动子上构建的杂合启动子。

8.如权利要求7所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,是以枯草芽孢杆菌BSGNY-Pveg-glmS-P43-GNA1为出发菌株;所述出发菌株以枯草芽孢杆菌168为基础,基因型作如下改造得到的:ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔptaΔglcKΔpckAΔpyk::lox72,并以启动子Pveg调控表达来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB与枯草芽孢杆菌168自身的glmS、在质粒上以启动子P43调控GNA1的重组表达。

9.一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法,其特征在于,所述方法是将权利要求7或8所述的重组枯草芽孢杆菌置于35-39℃、200-220rpm下培养10-15h的种子以1-10%的接种量转入摇瓶发酵培养基,35-39℃、200-220pm条件下培养50-70h;或,所述方法是将权利要求7或8所述的重组枯草芽孢杆菌置于35-39℃、200-220rpm下培养10-15h的种子以1-10%的接种量转入上罐发酵培养基,于装液量为30-50%的发酵罐中,35-39℃、pH 6.5-7.5条件下培养,通气量为1-2vvm,转速控制在500-900rpm之间维持溶氧在30%以上,持续流加750g/L以控制葡萄糖浓度在1-30g/L之间。

10.权利要求7-8任一所述的重组枯草芽孢杆菌或权利要求1-6任一所述的促进N-乙酰氨基葡萄糖合成的方法在食品、制药、营养保健品或者化妆品领域中的应用。