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专利号: 2019113287873
申请人: 华南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种可视化绿色荧光伪狂犬病毒,其特征在于,在伪狂犬病毒的次要骨架蛋白VP24的Met-1/Gly-2之间插入含有荧光蛋白的片段。

2.根据权利要求1所述的可视化绿色荧光伪狂犬病毒,其特征在于,所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白为EGFP。

3.一种可视化绿色荧光伪狂犬病毒的构建方法,其特征在于,在伪狂犬病毒的次要骨架蛋白的Met-1/Gly-2之间插入有荧光蛋白。

4.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,利用CRISPR/Cas9技术。

5.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:

S1.设计sgRNA靶标序列,并根据其合成互补引物序列,退火后连接入pCRISPR/Cas9载体,得到识别剪切UL26(VP24)的CRISPR/Cas9质粒pCas9-VP24;

S2.以克隆载体为骨架载体,插入伪狂犬病毒UL26(VP24)的Met-1/Gly-2两端的序列作为左右同源臂,左右同源臂间插入Thr-Thr-Ser-Ala-Thr和EGFP基因,构建重组载体pBSK-UL26-EGFP-UL25;

S3.将重组载体pBSK-UL26-EGFP-UL25、伪狂犬病毒和CRISPR/Cas9质粒pCas9-VP24转染PK-15细胞,通过克隆筛选,获得含EGFP标记蛋白的病毒株PRV-VP24-EGFP。

6.根据权利要求5所述的构建方法,其特征在于,步骤S1中,互补引物序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~2所示。

7.根据权利要求6所述的构建方法,其特征在于,步骤S2中,在克隆载体中插入的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

8.根据权利要求7所述的构建方法,其特征在于,步骤S2中,具体包括以下步骤:S21.分别使用核苷酸序列如SEQ ID NO.3~4所示和核苷酸序列如SEQ ID NO.5~6所示引物,以伪狂犬病毒DNA为模板,扩增同源左臂和同源右臂;

S22.使用核苷酸序列如SEQ ID NO.7~8所示引物,以携带有EGFP基因的质粒为模板,扩增同源左右臂间插入的Thr-Thr-Ser-Ala-Thr和EGFP基因序列;

S23.线性化克隆载体;

S24.将S21、S22、和S23的产物混合反应,得到重组载体M-pBSK-UL26-EGFP-UL25。

9.根据权利要求9所述的构建方法,其特征在于,步骤S24中,将S21、S22、和S23的产物混合的质量比为:50~200:50~200:50~200:25~100g。