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专利号: 2019113447177
申请人: 长江大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2024-02-28
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种ALV‑K的ELISA试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括以下组分:酶标板;

样品稀释液,为去离子水;

包被液,以纯化的重组HIS‑K‑gp85蛋白免疫雌性新西兰大耳兔,静脉采血,离心,经过硫酸铵沉淀法纯化,得到兔多抗KE7作为包被抗体,采用所述样品稀释液稀释所述包被抗体至4μg/100μL,得到所述包被液,其中所述重组HIS‑K‑gp85蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示;

洗涤液,为PBST;

封闭液,为5%脱脂乳;

TMB底物显色液;

终止液,为2mol/L的硫酸溶液;

HRP酶标;

标准阳性样品;以及

标准阴性对照样品;

其中5%脱脂乳的封闭时间为1.5h;一抗稀释后浓度为0.2μg/100μL孵育2h;HRP酶标二抗稀释度为1:2000,二抗孵育1h;底物显色20min。

2.根据权利要求1所述的一种ALV‑K的ELISA试剂盒,其特征在于,所述重组HIS‑K‑gp85蛋白的制备方法包括:通过将如SEQ ID NO:1所示的基因克隆到表达载体上,得到重组表达载体;将所述重组表达载体转化到宿主细胞中进行表达,纯化,得到所述重组HIS‑K‑gp85蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种ALV‑K的ELISA试剂盒,其特征在于,所述表达载体为pET28a,所述宿主细胞为E. coli BL21。

4.据权利要求2所述的一种ALV‑K的ELISA试剂盒,其特征在于,所述重组HIS‑K‑gp85蛋白的制备方法包括以下步骤:

(1)HIS‑K‑gp85基因扩增:以如SEQ ID NO:1所示的基因为模板,以gp85‑F和gp85‑R为引物,对HIS‑K‑gp85基因进行PCR扩增;扩增的片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收,并进行TOPO克隆,构建克隆载体TOPO‑ALV‑K‑gp85,其中正向引物gp85‑F的序列如SEQ ID NO: 

2所示,反向引物gp85‑R的序列如SEQ ID NO: 3所示;

(2)重组表达载体构建:将克隆载体TOPO‑ALV‑K‑gp85和pET‑28a质粒分别进行双酶切,回收gp85片段,与经酶切的pET‑28a片段连接,连接之后的产物转化至DH5α菌细胞内,培养后挑选阳性菌落,经鉴定,得到重组表达载体pET‑28a‑ALV‑K‑gp85;

(3)诱导表达:将所述重组表达载体pET‑28a‑ALV‑K‑gp85转化进E. coli BL21菌株中,复苏和培养后,挑选阳性并经鉴定正确的菌落进行诱导表达;

(4)重组HIS‑K‑gp85蛋白的纯化:诱导后菌体经溶解,超声裂解,裂解液上Ni柱,纯化后的蛋白进行鉴定,分装保存。

5.如权利要求1所述ALV‑K的ELISA试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将所述包被液加入至所述酶标板的每孔中,于4℃包被过夜后,甩板,用所述洗涤液洗涤;

(2)每孔中加入所述封闭液,封闭,用所述洗涤液洗涤;

(3)加入待测样品,孵育后用所述洗涤液洗涤;

(4)加入所述兔多抗KE7作为一抗,孵育后用所述洗涤液洗涤;

(5)加入所述HRP酶标记的所述兔多抗KE7作为二抗,孵育后用所述洗涤液洗涤;

(6)每孔中加入所述TMB底物显色液,显色;

(7)加入所述终止液终止;

(8)用酶标仪测450nm处吸光值,当P/N≥2时,判定样品为阳性;当P/N<2时,判定样品为阴性。

6.如权利要求1‑4任一项所述的ALV‑K的ELISA试剂盒在制备血清学检测产品中的应用。